Зажим напряжения

Зажим напряжения работает по принципу отрицательной обратной связи . Усилитель мембранного потенциала измеряет мембранное напряжение и посылает выходной сигнал на усилитель обратной связи; он вычитает мембранное напряжение из командного напряжения, которое он получает от генератора сигналов. Этот сигнал усиливается, и выходной сигнал отправляется в аксон через электрод , проходящий ток .

Зажим напряжения — это экспериментальный метод, используемый электрофизиологами для измерения ионных токов через мембраны возбудимых клеток, таких как нейроны , при этом удерживая мембранное напряжение на установленном уровне. ^[1] Базовый зажим напряжения будет итеративно измерять мембранный потенциал , а затем изменять мембранный потенциал (напряжение) до желаемого значения, добавляя необходимый ток. Это «зажимает» клеточную мембрану при желаемом постоянном напряжении, позволяя зажиму напряжения регистрировать, какие токи подаются. Поскольку токи, приложенные к клетке, должны быть равны (и противоположны по заряду ) току, проходящему через клеточную мембрану при установленном напряжении, зарегистрированные токи показывают, как клетка реагирует на изменения мембранного потенциала. ^[2] Клеточные мембраны возбудимых клеток содержат много различных видов ионных каналов , некоторые из которых являются потенциалзависимыми . Зажим напряжения позволяет манипулировать мембранным напряжением независимо от ионных токов, позволяя изучать соотношения тока и напряжения мембранных каналов. ^[3]

История

Концепция зажима напряжения приписывается Кеннету Коулу ^[4] и Джорджу Мармонту ^[5] весной 1947 года. ^[6] Они вставили внутренний электрод в гигантский аксон кальмара и начали подавать ток. Коул обнаружил, что можно использовать два электрода и цепь обратной связи , чтобы удерживать мембранный потенциал клетки на уровне, установленном экспериментатором.

Коул разработал технику фиксации напряжения до эры микроэлектродов , поэтому его два электрода состояли из тонких проводов, скрученных вокруг изолирующего стержня. Поскольку этот тип электрода можно было вставить только в самые большие клетки, ранние электрофизиологические эксперименты проводились почти исключительно на аксонах кальмаров .

Личная фотография Кеннета Коула, переданная доктору Дж. Уолтеру Вудбери.

Кальмары выпускают струи воды, когда им нужно быстро двигаться, например, спасаясь от хищника. Чтобы сделать этот побег максимально быстрым, у них есть аксон , который может достигать 1 мм в диаметре (сигналы распространяются быстрее по большим аксонам). Гигантский аксон кальмара был первым препаратом, который можно было использовать для фиксации напряжения трансмембранного тока, и он был основой пионерских экспериментов Ходжкина и Хаксли по свойствам потенциала действия. ^[6]

Алан Ходжкин понял, что для понимания потока ионов через мембрану необходимо устранить различия в мембранном потенциале. ^[7] Используя эксперименты с зажимом напряжения, Ходжкин и Эндрю Хаксли опубликовали 5 статей летом 1952 года, описывающих, как ионные токи вызывают потенциал действия . ^[8] В последней статье была предложена модель Ходжкина-Хаксли , которая математически описывает потенциал действия. Использование зажимов напряжения в их экспериментах для детального изучения и моделирования потенциала действия заложило основу электрофизиологии ; за что они разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1963 года . ^[7]

Техника

Зажим напряжения представляет собой генератор тока. Трансмембранное напряжение регистрируется через «электрод напряжения» относительно земли , а «токовой электрод» пропускает ток в клетку. Экспериментатор устанавливает «удерживающее напряжение» или «командный потенциал», а зажим напряжения использует отрицательную обратную связь для поддержания клетки при этом напряжении. Электроды подключены к усилителю, который измеряет мембранный потенциал и подает сигнал в усилитель обратной связи . Этот усилитель также получает входной сигнал от генератора сигналов, который определяет командный потенциал, и он вычитает мембранный потенциал из командного потенциала (V _command – V _m ), увеличивает любую разницу и отправляет выходной сигнал на токовый электрод. Всякий раз, когда клетка отклоняется от удерживающего напряжения, операционный усилитель генерирует «сигнал ошибки», то есть разницу между командным потенциалом и фактическим напряжением клетки. Цепь обратной связи пропускает ток в клетку, чтобы уменьшить сигнал ошибки до нуля. Таким образом, цепь зажима производит ток, равный и противоположный ионному току.

Вариации техники фиксации напряжения

Двухэлектродный зажим напряжения с использованием микроэлектродов

Двухэлектродный зажим напряжения

Метод двухэлектродного зажима напряжения (TEVC) используется для изучения свойств мембранных белков, особенно ионных каналов. ^[9] Исследователи чаще всего используют этот метод для изучения мембранных структур, экспрессируемых в ооцитах Xenopus . Большой размер этих ооцитов обеспечивает простоту обращения и манипуляции. ^[10]

Метод TEVC использует две пипетки с низким сопротивлением, одна из которых измеряет напряжение, а другая вводит ток. Микроэлектроды заполняются проводящим раствором и вставляются в клетку для искусственного управления мембранным потенциалом. Мембрана действует как диэлектрик, а также как резистор , в то время как жидкости по обе стороны мембраны функционируют как конденсаторы . ^[10] Микроэлектроды сравнивают мембранный потенциал с командным напряжением, обеспечивая точное воспроизведение токов, протекающих через мембрану. Показания тока можно использовать для анализа электрического отклика клетки на различные приложения.

Этот метод предпочтительнее, чем одноэлектродный зажим или другие методы зажима напряжения, когда условия требуют разрешения больших токов. Высокая пропускная способность двухэлектродного зажима позволяет зажимать большие токи, которые невозможно контролировать с помощью одноэлектродных патч-методов . ^[11] Двухэлектродная система также желательна из-за быстрого времени установления зажима и низкого уровня шума. Однако TEVC ограничен в использовании в отношении размера клеток. Он эффективен в ооцитах большего диаметра, но его сложнее использовать с маленькими клетками. Кроме того, метод TEVC ограничен тем, что передатчик тока должен находиться в пипетке. Невозможно манипулировать внутриклеточной жидкостью во время зажима, что возможно с помощью методов патч-клемм. ^[2] Еще один недостаток связан с проблемами «пространственного зажима». Зажим напряжения Коула использовал длинный провод, который зажимал аксон кальмара равномерно по всей его длине. Микроэлектроды TEVC могут обеспечить только пространственный точечный источник тока, который может неравномерно влиять на все части клетки неправильной формы.

Двухэлементный зажим напряжения

Метод двухклеточного зажима напряжения является специализированной вариацией двухэлектродного зажима напряжения и используется только при изучении каналов щелевых контактов . ^[12] Щелевые контакты представляют собой поры, которые напрямую связывают две клетки, через которые свободно протекают ионы и небольшие молекулы. Когда две клетки, в которых экспрессируются белки щелевых контактов, обычно коннексины или иннексины , либо эндогенно, либо посредством инъекции мРНК , между клетками образуется соединительный канал. Поскольку в системе присутствуют две клетки, используются два набора электродов. Регистрирующий электрод и электрод для подачи тока вставляются в каждую клетку, и каждая клетка зажимается индивидуально (каждый набор электродов прикреплен к отдельному аппарату, а интеграция данных выполняется компьютером). Для записи проводимости соединения ток изменяется в первой ячейке, в то время как регистрирующий электрод во второй ячейке регистрирует любые изменения V _m только для второй клетки. (Процесс может быть обратным, если стимул происходит во второй клетке, а запись происходит в первой клетке.) Поскольку электрод не вызывает никаких изменений тока в регистрируемой клетке, любое изменение напряжения должно быть вызвано переходом тока в регистрируемую клетку через щелевые контакты из клетки, в которой изменялся ток. ^[12]

Одноэлектродный зажим напряжения

Эта категория описывает набор методов, в которых один электрод используется для фиксации напряжения. Метод непрерывного одноэлектродного зажима (SEVC-c) часто используется с записью пэтч-зажима. Метод прерывистого одноэлектродного зажима напряжения (SEVC-d) используется с проникающей внутриклеточной записью. Этот один электрод выполняет функции как инъекции тока, так и регистрации напряжения.

Непрерывный одноэлектродный зажим (SEVC-c)

Метод «patch-clamp» позволяет изучать отдельные ионные каналы. Он использует электрод с относительно большим наконечником (> 1 микрометра), который имеет гладкую поверхность (а не острый наконечник). Это «patch-clamp электрод» (в отличие от «острого электрода», используемого для прокалывания клеток). Этот электрод прижимается к клеточной мембране, и применяется отсасывание, чтобы втянуть мембрану клетки внутрь наконечника электрода. Отсасывание заставляет клетку образовывать плотное уплотнение с электродом («гигаомное уплотнение», поскольку сопротивление больше гигаома ) .

SEV-c имеет преимущество в том, что вы можете записывать из маленьких клеток, которые невозможно проткнуть двумя электродами. Однако:

1. Микроэлектроды являются несовершенными проводниками; в общем, они имеют сопротивление более миллиона Ом . Они выпрямляют (т. е. изменяют свое сопротивление с напряжением, часто нерегулярным образом), иногда они имеют нестабильное сопротивление, если засорены содержимым ячейки. Таким образом, они не будут точно регистрировать напряжение ячейки, особенно когда оно быстро меняется, и не будут точно пропускать ток.
2. Ошибки напряжения и тока: схема SEV-c на самом деле не измеряет напряжение зажимаемой клетки (как это делает двухэлектродный зажим). Усилитель с патч-клампом похож на двухэлектродный зажим, за исключением того, что цепи измерения напряжения и прохождения тока соединены (в двухэлектродном зажиме они соединены через ячейку ). Электрод прикреплен к проводу, который контактирует с контуром тока/напряжения внутри усилителя. Таким образом, электрод оказывает только косвенное влияние на цепь обратной связи. Усилитель считывает только напряжение в верхней части электрода и подает обратный ток для компенсации. Но если электрод является несовершенным проводником, схема зажима имеет только искаженное представление о мембранном потенциале. Аналогично, когда схема передает обратный ток для компенсации этого (искаженного) напряжения, ток будет искажен электродом до того, как он достигнет клетки. Чтобы компенсировать это, электрофизиолог использует электрод с наименьшим возможным сопротивлением, следит за тем, чтобы характеристики электрода не менялись во время эксперимента (поэтому ошибки будут постоянными), и избегает регистрации токов с кинетикой, которая, вероятно, будет слишком быстрой для точного отслеживания зажимом. Точность SEV-c тем выше, чем медленнее и меньше изменения напряжения, которые он пытается зафиксировать.
3. Ошибки последовательного сопротивления: токи, проходящие через ячейку, должны уходить на землю, чтобы замкнуть цепь. Напряжения регистрируются усилителем относительно земли. Когда ячейка зажимается на своем естественном потенциале покоя , проблем нет; зажим не пропускает ток, и напряжение генерируется только ячейкой. Но при зажиме на другом потенциале ошибки последовательного сопротивления становятся проблемой; ячейка будет пропускать ток через свою мембрану, пытаясь вернуться к своему естественному потенциалу покоя. Усилитель зажима противодействует этому, пропуская ток для поддержания удерживающего потенциала. Проблема возникает из-за того, что электрод находится между усилителем и ячейкой; т. е. электрод включен последовательно с резистором, который является мембраной ячейки. Таким образом, при пропускании тока через электрод и ячейку закон Ома говорит нам, что это приведет к образованию напряжения как на сопротивлении ячейки, так и на сопротивлении электрода. Поскольку эти резисторы включены последовательно, падения напряжения будут складываться. Если электрод и клеточная мембрана имеют одинаковое сопротивление (что обычно не так), и если экспериментатор командует на изменение на 40 мВ от потенциала покоя, усилитель будет пропускать достаточно тока, пока не покажет, что он достиг этого изменения на 40 мВ. Однако в этом примере половина этого падения напряжения приходится на электрод. Экспериментатор думает, что он или она изменили напряжение клетки на 40 мВ, но изменили его только на 20 мВ. Разница заключается в «погрешности последовательного сопротивления». Современные усилители с патч-клампом имеют схемы для компенсации этой ошибки, но они компенсируют только 70-80% от нее. Электрофизиолог может еще больше уменьшить ошибку, регистрируя на уровне или около естественного потенциала покоя клетки и используя электрод с как можно более низким сопротивлением.
4. Ошибки емкости. Микроэлектроды являются конденсаторами и особенно неприятны, поскольку они нелинейны. Емкость возникает из-за того, что электролит внутри электрода отделен изолятором (стеклом) от раствора снаружи. По определению и функции это конденсатор. Хуже того, поскольку толщина стекла изменяется по мере удаления от наконечника, постоянная времени конденсатора будет меняться. Это приводит к искаженной записи мембранного напряжения или тока всякий раз, когда они меняются. Усилители могут компенсировать это, но не полностью, поскольку емкость имеет много постоянных времени. Экспериментатор может уменьшить проблему, сохраняя раствор для купания ячейки неглубоким (меньше подвергая поверхность стекла воздействию жидкости) и покрывая электрод силиконом, смолой, краской или другим веществом, которое увеличит расстояние между внутренним и внешним растворами.
5. Ошибки пространственного зажима. Один электрод является точечным источником тока. В отдаленных частях клетки ток, проходящий через электрод, будет иметь меньшее влияние, чем в близлежащих частях клетки. Это особенно проблема при записи от нейронов со сложными дендритными структурами. С ошибками пространственного зажима ничего нельзя сделать, кроме как смягчить выводы эксперимента.

Прерывистый одноэлектродный зажим напряжения (SEVC-d)

Одноэлектродный зажим напряжения — прерывистый, или SEVC-d, имеет некоторые преимущества перед SEVC-c для записи всей клетки. В этом случае используется другой подход для пропускания тока и записи напряжения. Усилитель SEVC-d работает на основе « разделения времени », поэтому электрод регулярно и часто переключается между пропусканием тока и измерением напряжения. По сути, есть два электрода, но каждый из них работает только половину времени, пока он включен. Колебание между двумя функциями одного электрода называется рабочим циклом. Во время каждого цикла усилитель измеряет мембранный потенциал и сравнивает его с удерживающим потенциалом. Операционный усилитель измеряет разницу и генерирует сигнал ошибки. Этот ток является зеркальным отражением тока, генерируемого клеткой. Выходы усилителя оснащены схемами выборки и хранения , поэтому каждое кратковременно выбранное напряжение затем удерживается на выходе до следующего измерения в следующем цикле. Если быть точным, усилитель измеряет напряжение в первые несколько микросекунд цикла, генерирует сигнал ошибки и тратит остаток цикла на пропускание тока, чтобы уменьшить эту ошибку. В начале следующего цикла напряжение измеряется снова, генерируется новый сигнал ошибки, пропускается ток и т. д. Экспериментатор устанавливает длину цикла, и можно производить выборку с периодами всего около 15 микросекунд, что соответствует частоте переключения 67 кГц. Частоты переключения ниже примерно 10 кГц недостаточны при работе с потенциалами действия шириной менее 1 миллисекунды. Обратите внимание, что не все прерывистые усилители с фиксацией напряжения поддерживают частоты переключения выше 10 кГц. ^[10]

Чтобы это работало, емкость ячейки должна быть выше емкости электрода как минимум на порядок величины . Емкость замедляет кинетику (время нарастания и спада) токов. Если емкость электрода намного меньше емкости ячейки, то при пропускании тока через электрод напряжение электрода будет меняться быстрее, чем напряжение ячейки. Таким образом, когда ток вводится, а затем выключается (в конце рабочего цикла), напряжение электрода будет спадать быстрее, чем напряжение ячейки. Как только напряжение электрода асимптотизируется к напряжению ячейки, напряжение можно снять (снова) и подать следующую величину заряда. Таким образом, частота рабочего цикла ограничена скоростью, с которой напряжение электрода растет и спадает при пропускании тока. Чем меньше емкость электрода, тем быстрее можно циклировать.

SEVC-d имеет большое преимущество перед SEVC-c, позволяя экспериментатору измерять мембранный потенциал, и, поскольку он устраняет необходимость пропускания тока и измерения напряжения одновременно, никогда не возникает ошибка последовательного сопротивления. Главные недостатки заключаются в том, что временное разрешение ограничено, а усилитель нестабилен. Если он пропускает слишком большой ток, так что целевое напряжение превышается, он меняет полярность тока в следующем рабочем цикле. Это приводит к тому, что он оказывается ниже целевого напряжения, поэтому следующий цикл снова меняет полярность введенного тока. Эта ошибка может расти с каждым циклом, пока усилитель не выйдет из-под контроля («звон»); это обычно приводит к разрушению регистрируемой клетки. Исследователь хочет получить короткий рабочий цикл для улучшения временного разрешения; усилитель имеет регулируемые компенсаторы, которые ускоряют падение напряжения на электроде, но если они установлены слишком высоко, усилитель будет звенеть, поэтому исследователь всегда пытается «настроить» усилитель как можно ближе к краю неконтролируемого колебания, и в этом случае небольшие изменения в условиях записи могут вызвать звон. Есть два решения: «откатить» настройки усилителя до безопасного диапазона или быть начеку, чтобы вовремя заметить признаки того, что усилитель вот-вот зазвонит.

Математическое моделирование

С точки зрения теории управления эксперимент с зажимом напряжения можно описать в терминах применения закона управления обратной связью с высоким коэффициентом усиления ^[13] к нейронной мембране. ^[14] Математически мембранное напряжение можно смоделировать с помощью модели на основе проводимости , где вход задается приложенным током , а выход задается мембранным напряжением . Исходная модель Ходжкина и Хаксли на основе проводимости, которая представляет собой нейронную мембрану, содержащую токи ионов натрия и калия , а также ток утечки , задается системой обыкновенных дифференциальных уравнений ${\displaystyle I_{app}(t)}$ ${\displaystyle V(t)}$

${\displaystyle C_{m}{\frac {dV}{dt}}=-{\bar {g}}_{\text{K}}n^{4}(V-V_{\text{K}})-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L}}(V-V_{L})+I_{app}}$

${\displaystyle {\frac {dp}{dt}}=\alpha _{p}(V)(1-p)-\beta _{p}(V)p,\quad p=m,n,h}$

где — емкость мембраны, , и — максимальные проводимости, , и — потенциалы реверсии, и — константы скорости ионного канала, зависящие от напряжения, а переменные состояния , , и — переменные управления ионным каналом . ${\displaystyle C_{m}}$ ${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{Na}}}$ ${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{K}}}$ ${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{L}}}$ ${\displaystyle V_{\text{Na}}}$ ${\displaystyle V_{\text{K}}}$ ${\displaystyle V_{\text{L}}}$ ${\displaystyle \alpha _{p}}$ ${\displaystyle \beta _{p}}$ ${\displaystyle m}$ ${\displaystyle h}$ ${\displaystyle n}$

Можно строго показать, что закон обратной связи

${\displaystyle I_{app}(t)=k(V_{\text{ref}}-V(t))}$

приводит мембранное напряжение произвольно близко к опорному напряжению , когда усиление увеличивается до произвольно большого значения. ^[14] Этот факт, который никоим образом не является общим свойством динамических систем (большое усиление может, в общем, привести к нестабильности ^[15] ), является следствием структуры и свойств модели, основанной на проводимости, приведенной выше. В частности, динамика каждой переменной стробирования , которая управляется , подтверждает свойство сильной стабильности экспоненциального сжатия. ^{[14] [16]} ${\displaystyle V(t)}$ ${\displaystyle V_{\text{ref}}}$ ${\displaystyle k>0}$ ${\displaystyle p=m,h,n}$ ${\displaystyle V}$

Ссылки

1. Новотны Т, Леви Р (2014). Джегер Д, Юнг Р (ред.). Энциклопедия вычислительной нейронауки . Springer New York. стр. 1–5. doi :10.1007/978-1-4614-7320-6_137-2. ISBN 9781461473206.
2. Hernández-Ochoa EO, Schneider MF (апрель 2012 г.). «Методы фиксации напряжения для изучения мембранных токов и высвобождения SR Ca(2+) во взрослых скелетных мышечных волокнах». Progress in Biophysics and Molecular Biology . 108 (3): 98–118. doi :10.1016/j.pbiomolbio.2012.01.001. PMC 3321118. PMID 22306655  . 
3. Кандель Э.Р., Шварц Дж.Х., Джесселл Т.М., ред. (2000). Принципы нейронауки (4-е изд.). Нью-Йорк: МакГроу-Хилл. стр. 152–3. ISBN 978-0-8385-7701-1.
4. Bear MF, Connors BW, Paradiso MA, ред. (2006) [1996]. Neuroscience: Exploring the Brain (3-е изд.). Филадельфия, Балтимор: Lippincott Williams & Wilkins. стр. 84. ISBN 978-0-7817-6003-4. LCC  QP355.2.B42.
5. Мур Дж. В., Хайнс М. Л. (1994). «Краткая история вычислительной нейронауки». Моделирование с помощью NEURON . Университет Дьюка.
6. Эндрю Хаксли, 1996, «Кеннет Стервард Коул 1900 – 1984, биографические мемуары» Национальная академия наук. (Вашингтон, округ Колумбия)
7. Huxley A (ноябрь 2002 г.). «От перенапряжения до фиксации напряжения». Trends in Neurosciences . 25 (11): 553–8. doi :10.1016/S0166-2236(02)02280-4. PMID  12392929. S2CID  7453707.
8. Ванденберг, Дж. И. и С. Г. Ваксман (2012). «Ходжкин и Хаксли и основа электрической сигнализации: замечательное наследие, которое все еще живо». J. Physiol. (Оксфорд, Великобритания) 590(11): 2569–2570.
9. Guan B, Chen X, Zhang H (2013). "Двухэлектродный зажим напряжения". Ионные каналы . Методы в молекулярной биологии. Т. 998. С. 79–89. doi :10.1007/978-1-62703-351-0_6. ISBN 978-1-62703-350-3. PMID  23529422.
10. Polder HR, Swandulla D (август 2001 г.). «Использование теории управления для проектирования систем фиксации напряжения: простая и стандартизированная процедура оценки параметров системы». Journal of Neuroscience Methods . 109 (2): 97–109. doi :10.1016/S0165-0270(01)00385-5. PMID  11513944. S2CID  44840152.
11. DiFranco M, Herrera A, Vergara JL (январь 2011 г.). «Хлоридные потоки из поперечной трубчатой ​​системы в волокнах скелетных мышц взрослых млекопитающих». Журнал общей физиологии . 137 (1): 21–41. doi :10.1085/jgp.201010496. PMC 3010054. PMID  21149546 . 
12. Ван Риджен Х.В., Вилдерс Р., Ван Гиннекен AC, Джонгсма HJ (июнь 1998 г.). «Количественный анализ двойного определения проводимости щелевого перехода с помощью фиксации напряжения в целой ячейке». Архив Пфлюгерса . 436 (1): 141–51. дои : 10.1007/s004240050615. PMID  9560458. S2CID  23697774.
13. Марино Р. (декабрь 1985 г.). «Высокоэффективная обратная связь в нелинейных системах управления». International Journal of Control . 42 (6): 1369–1385. doi :10.1080/00207178508933431.
14. Burghi TB, Schoukens M, Sepulchre R (2021). "Идентификация обратной связи моделей на основе проводимости" (PDF) . Automatica . 123 : 109297. doi :10.1016/j.automatica.2020.109297. S2CID  211258619.
15. "Системы управления/Усиление - Wikibooks, открытые книги для открытого мира". en.wikibooks.org . Получено 2021-04-06 .
16. Lohmiller W, Slotine JJ (1998). «О контракционном анализе нелинейных систем». Automatica . 34 (6): 683–696. CiteSeerX 10.1.1.368.3925 . doi :10.1016/S0005-1098(98)00019-3. S2CID  8763452. 

Дальнейшее чтение

• Шерман-Голд Р., ред. (1993). "Биоэлектричество" (PDF) . Руководство Axon по электрофизиологии и биофизическим лабораторным методам . Axon Instruments. стр. 1–16. OCLC  248830666.