Оптическое секционирование

Оптическое секционирование — это процесс, посредством которого соответствующим образом спроектированный микроскоп может создавать четкие изображения фокальных плоскостей глубоко внутри толстого образца. Это используется для уменьшения необходимости в тонком сечении с использованием таких инструментов, как микротом . Используется множество различных методов оптического секционирования, и несколько методов микроскопии специально разработаны для улучшения качества оптического секционирования.

Хорошее оптическое секционирование, часто называемое хорошим разрешением по глубине или z, популярно в современной микроскопии, поскольку оно позволяет проводить трехмерную реконструкцию образца на основе изображений, полученных в различных фокальных плоскостях.

Оптическое секционирование в традиционных световых микроскопах

В идеальном микроскопе только свет из фокальной плоскости может достигать детектора ( обычно наблюдателя или ПЗС ), создавая четкое изображение плоскости образца, на котором сфокусирован микроскоп. К сожалению, микроскоп не настолько специфичен, и свет из источников за пределами фокальной плоскости также достигает детектора; в толстом образце может быть значительное количество материала, а значит, и паразитный сигнал, между фокальной плоскостью и объективом .

Без модификации микроскопа, т. е. с простым широкопольным световым микроскопом , качество оптического сечения регулируется той же физикой, что и эффект глубины резкости в фотографии . Для объектива с высокой числовой апертурой , эквивалентной широкой апертуре , глубина резкости мала ( мелкий фокус ) и дает хорошее оптическое сечение. Объективы с большим увеличением обычно имеют более высокие числовые апертуры (и, следовательно, лучшее оптическое сечение), чем объективы с малым увеличением. Масляные иммерсионные объективы обычно имеют еще большие числовые апертуры, поэтому улучшенное оптическое сечение.

Разрешение по глубине («z-разрешение») стандартного широкопольного микроскопа зависит от числовой апертуры и длины волны света и может быть приблизительно выражено как :

$D_{z}={\frac {\lambda n}{(\mathrm {NA})^{2}}}$ где λ — длина волны, n — показатель преломления иммерсионной среды объектива, а NA — числовая апертура. ^[2]

Для сравнения, латеральное разрешение можно приблизительно рассчитать следующим образом: ^[3]

$D_{x}=D_{y}={\frac {0,61\lambda }{\mathrm {NA} }}$

Методы улучшения оптического сечений

Световая микроскопия в светлом поле

Помимо увеличения числовой апертуры, существует несколько методов улучшения оптического среза в микроскопии светлого поля. Большинство микроскопов с масляными иммерсионными объективами достигают пределов возможной числовой апертуры из-за ограничений рефракции .

Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) обеспечивает скромные улучшения оптического секционирования. В DIC образец эффективно освещается двумя слегка смещенными источниками света, которые затем интерферируют, создавая изображение, полученное из разности фаз двух источников. Поскольку смещение в источниках света мало, единственная разница в фазе возникает из-за материала, близкого к фокальной плоскости.

Флуоресцентная микроскопия

В флуоресцентной микроскопии объекты вне фокальной плоскости только мешают изображению, если они освещены и флуоресцируют. Это добавляет дополнительный способ, с помощью которого можно улучшить оптическое секционирование, сделав освещение специфическим только для фокальной плоскости.

Конфокальная микроскопия использует сканирующую точку или точки света для освещения образца. В сочетании с точечным отверстием в сопряженной фокальной плоскости это действует для фильтрации света от источников вне фокальной плоскости для улучшения оптического сечения. ^[4]

Флуоресцентная микроскопия на основе светового листа освещает образец возбуждающим светом под углом 90° к направлению наблюдения, т.е. освещается только фокальная плоскость с помощью лазера, сфокусированного только в одном направлении (световой лист). ^[5] Этот метод эффективно уменьшает свет, находящийся вне фокуса, и может дополнительно привести к небольшому улучшению продольного разрешения по сравнению с эпифлуоресцентной микроскопией.

Методы двойного и многофотонного возбуждения используют тот факт, что флуорофоры могут возбуждаться не только одним фотоном правильной энергии , но и несколькими фотонами, которые вместе обеспечивают правильную энергию. Дополнительный эффект, зависящий от « концентрации », требующий одновременного взаимодействия нескольких фотонов с флуорофором, дает стимуляцию только очень близко к фокальной плоскости. Эти методы обычно используются в сочетании с конфокальной микроскопией. ^[6]

Дальнейшие усовершенствования оптического секционирования находятся в стадии активной разработки, они в основном работают с помощью методов обхода дифракционного предела света. Примерами являются однофотонная интерферометрия через две объективные линзы для получения чрезвычайно точной информации о глубине одного флуорофора ^[7] и трехмерная структурированная микроскопия освещения. ^[8]

Оптическое секционирование обычных широкопольных микроскопов можно значительно улучшить с помощью деконволюции — метода обработки изображений, позволяющего устранить размытость изображения в соответствии с измеренной или рассчитанной функцией рассеяния точки . ^[9]

Клиринговые агенты

Оптическое секционирование можно улучшить, используя просветляющие агенты с высоким показателем преломления (>1,4), такие как бензиловый спирт/бензилбензоат (BABB) или бензиловый эфир ^[10] , которые делают образцы прозрачными и, следовательно, позволяют наблюдать за внутренними структурами.

Другой

Оптическое секционирование недостаточно развито в несветовых микроскопах. ^{[ необходима цитата ]}

Рентгеновские и электронные микроскопы обычно имеют большую глубину резкости (плохое оптическое сечении), поэтому тонкое сечении образцов по-прежнему широко используется.

Хотя в основе процесса фокусировки лежат схожие физические принципы ^{[11] ,} сканирующие зондовые микроскопы и сканирующие электронные микроскопы обычно не обсуждаются в контексте оптического секционирования, поскольку эти микроскопы взаимодействуют только с поверхностью образца.

Микроскопия полного внутреннего отражения — это метод флуоресцентной микроскопии, который намеренно ограничивает наблюдение либо верхней, либо нижней поверхностью образца, но с чрезвычайно высоким разрешением по глубине.

Теоретически и экспериментально было продемонстрировано, что 3D-визуализация с использованием комбинации фокального сечения и наклона обеспечивает исключительное 3D-разрешение в больших полях зрения. ^[12]

Альтернативы

Основными альтернативами оптическому секционированию являются:

Тонкий срез образца, например, используемый в гистологии .
Томография , которая особенно хорошо развита для просвечивающей электронной микроскопии .

Ссылки

^ Цянь, Цзя; Лей, Мин; Дэн, Дэн; Яо, Баоли; Чжоу, Син; Ян, Янлун; Ян, Шаохуэй; Мин, Цзюньвэй; Ю, Сянхуа (2015). «Полноцветная оптическая микроскопия срезов со структурированным освещением». Научные отчеты . 5 : 14513. Бибкод : 2015NatSR...514513Q. дои : 10.1038/srep14513. ПМЦ 4586488 . ПМИД 26415516.
^ Nikon MicroscopyU – Глубина резкости и глубина фокуса
^ Nikon MicroscopyU – Разрешение
^ Conchello JA, Lichtman JW (декабрь 2005 г.). «Оптическая микроскопия срезов». Nat. Methods . 2 (12): 920–31. doi :10.1038/nmeth815. PMID 16299477. S2CID 17722926.
^ Huisken, J.; Swoger, J.; Bene, F. Del; Wittbrodt, J.; Stelzer, EH (2004). «Оптическое секционирование глубоко внутри живых эмбрионов с помощью микроскопии селективного плоскостного освещения». Science . 305 (5686): 1007–1009. Bibcode :2004Sci...305.1007H. CiteSeerX 10.1.1.456.2250 . doi :10.1126/science.1100035. PMID 15310904. S2CID 3213175.
^ Gratton E, Barry NP, Beretta S, Celli A (сентябрь 2001 г.). «Многофотонная флуоресцентная микроскопия». Методы . 25 (1): 103–10. doi :10.1006/meth.2001.1219. PMID 11559001. S2CID 822155.
^ Shtengel G, Galbraith JA, Galbraith CG и др. (март 2009 г.). «Интерферометрическая флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения позволяет распознавать 3D клеточную ультраструктуру». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 106 (9): 3125–30. Bibcode :2009PNAS..106.3125S. doi : 10.1073/pnas.0813131106 . PMC 2637278 . PMID 19202073.
^ Carlton PM (2008). «Трехмерная структурированная иллюминационная микроскопия и ее применение к структуре хромосом». Chromosome Res . 16 (3): 351–65. doi : 10.1007/s10577-008-1231-9 . PMID 18461477.
^ Sibarita JB (2005). «Деконволюционная микроскопия». Adv. Biochem. Eng. Biotechnol . Достижения в области биохимической инженерии/биотехнологии. 95 : 201–43. doi :10.1007/b102215. ISBN 978-3-540-23698-6. PMID 16080270.
^ Беккер, К., Ярлинг, Н., Сагафи, С., Вайлер, Р. и Додт, Х. У. (2012). «Химическая очистка и дегидратация мозга мышей, экспрессирующих GFP». PLOS ONE . 7 (3): e33916. Bibcode : 2012PLoSO...733916B. doi : 10.1371/journal.pone.0033916 . PMC 3316521. PMID 22479475 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ Борисевич, AY; Лупини, AR; Пенникук, SJ (21 февраля 2006 г.). «Глубинное секционирование с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа с коррекцией аберраций». Труды Национальной академии наук . 103 (9): 3044–3048. Bibcode : 2006PNAS..103.3044B. doi : 10.1073/pnas.0507105103 . PMC 1413870. PMID 16492746 .
^ Ховден, Р.; Эрциус, П. (2014). «Преодоление предела Кроутера: объединение глубинного секционирования и наклонной томографии для высокоразрешающих широкоугольных 3D-реконструкций». Ультрамикроскопия . 140 : 26–31. arXiv : 1402.0028 . doi : 10.1016/j.ultramic.2014.01.013. PMID 24636875. S2CID 41919418.