Микроскоп (от др.-греч. μικρός ( mikrós ) «маленький» и σκοπέω ( skopéō ) «смотреть (на); исследовать, осматривать») — лабораторный прибор, используемый для исследования объектов, которые слишком малы, чтобы быть видимыми невооруженным глазом . Микроскопия — это наука об исследовании малых объектов и структур с помощью микроскопа. Микроскопический означает невидимый глазу без помощи микроскопа.
Существует много типов микроскопов, и их можно сгруппировать по-разному. Один из способов — описать метод, который прибор использует для взаимодействия с образцом и получения изображений, либо посылая луч света или электронов через образец на его оптическом пути , либо детектируя излучение фотонов из образца, либо сканируя поперек и на небольшом расстоянии от поверхности образца с помощью зонда. Наиболее распространенным микроскопом (и первым из изобретенных) является оптический микроскоп , который использует линзы для преломления видимого света , прошедшего через тонко срезанный образец, для получения наблюдаемого изображения. Другими основными типами микроскопов являются флуоресцентный микроскоп , электронный микроскоп (как просвечивающий электронный микроскоп , так и сканирующий электронный микроскоп ) и различные типы сканирующих зондовых микроскопов . [1]
Хотя предметы, напоминающие линзы, датируются 4000 лет назад, и существуют греческие описания оптических свойств заполненных водой сфер (V в. до н. э.), за которыми последовали многие столетия трудов по оптике, самое раннее известное использование простых микроскопов ( увеличительных стекол ) относится к широкому использованию линз в очках в XIII веке. [2] [3] [4] Самые ранние известные примеры составных микроскопов, которые объединяют объективную линзу около образца с окуляром для просмотра реального изображения , появились в Европе около 1620 года. [5] Изобретатель неизвестен, хотя на протяжении многих лет было сделано много заявлений. Некоторые из них связаны с центрами изготовления очков в Нидерландах , включая утверждения, что он был изобретен в 1590 году Захариасом Янссеном (утверждение сделано его сыном) или отцом Захариаса, Гансом Мартенсом, или обоими, [6] [7] утверждает, что он был изобретен их соседом и конкурентом, изготовителем очков, Гансом Липпершеем (который подал заявку на первый патент на телескоп в 1608 году), [8] и утверждает, что он был изобретен эмигрантом Корнелисом Дреббелем , у которого, как было отмечено, была версия в Лондоне в 1619 году. [9] [10] Галилео Галилей (также иногда упоминаемый как изобретатель составного микроскопа), похоже, обнаружил после 1610 года, что он может близко фокусировать свой телескоп, чтобы рассматривать небольшие объекты, и, увидев составной микроскоп, построенный Дреббелем, выставленный в Риме в 1624 году, построил свою собственную улучшенную версию. [11] [12] [13] Джованни Фабер придумал название микроскоп для составного микроскопа, который Галилей представил в Академию деи Линчеи в 1625 году [14] (Галилей называл его occhiolino «маленький глаз»). Рене Декарт ( Dioptrique , 1637) описывает микроскопы, в которых вогнутое зеркало, обращенное вогнутостью к объекту, используется вместе с линзой для освещения объекта, который устанавливается на точке, фиксирующей его в фокусе зеркала. [15]
.jpg/1280px-Binocular_compound_microscope,_Carl_Zeiss_Jena,_1914_(6779276516).jpg)
Первое подробное описание микроскопической анатомии органических тканей, основанное на использовании микроскопа, появилось лишь в 1644 году в работе Джамбаттисты Одиерны «L'occhio della mosca» (« Глаз мухи») . [16]
Микроскоп был в значительной степени новинкой до 1660-х и 1670-х годов, когда натуралисты в Италии, Нидерландах и Англии начали использовать их для изучения биологии. Итальянский ученый Марчелло Мальпиги , которого некоторые историки биологии называют отцом гистологии , начал свой анализ биологических структур с легких. Публикация в 1665 году книги Роберта Гука « Микрография» оказала огромное влияние, в основном из-за ее впечатляющих иллюстраций. Гук создал крошечные линзы из маленьких стеклянных шариков, изготовленных путем сплавления концов нитей стекловолокна. [15] Значительный вклад внес Антони ван Левенгук , который добился увеличения до 300 раз с помощью простого однолинзового микроскопа. Он поместил очень маленькую стеклянную шаровидную линзу между отверстиями в двух металлических пластинах, склепанных вместе, и с регулируемой с помощью винтов иглой, прикрепленной для крепления образца. [17] Затем Ван Левенгук заново открыл красные кровяные клетки (после Яна Сваммердама ) и сперматозоиды , и помог популяризировать использование микроскопов для изучения биологической ультраструктуры. 9 октября 1676 года Ван Левенгук сообщил об открытии микроорганизмов. [16]
Производительность составного светового микроскопа зависит от качества и правильного использования системы конденсорных линз для фокусировки света на образце и объективной линзы для захвата света от образца и формирования изображения. [5] Ранние приборы были ограничены, пока этот принцип не был полностью оценен и разработан с конца 19-го до самого начала 20-го века, и пока электрические лампы не стали доступны в качестве источников света. В 1893 году Август Кёлер разработал ключевой принцип освещения образца, освещение по Кёлеру , которое является центральным для достижения теоретических пределов разрешения для светового микроскопа. Этот метод освещения образца обеспечивает равномерное освещение и преодолевает ограниченный контраст и разрешение, налагаемые ранними методами освещения образца. Дальнейшие разработки в освещении образца произошли с открытием фазового контраста Фрицем Цернике в 1953 году и дифференциального интерференционного контрастного освещения Жоржем Номарски в 1955 году; оба они позволяют получать изображения неокрашенных прозрачных образцов.
В начале 20 века была разработана существенная альтернатива световому микроскопу — прибор, который использует пучок электронов вместо света для создания изображения. Немецкий физик Эрнст Руска , работая с инженером-электриком Максом Кноллем , разработал первый прототип электронного микроскопа в 1931 году — просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ). Просвечивающий электронный микроскоп работает по тем же принципам, что и оптический микроскоп, но использует электроны вместо света и электромагниты вместо стеклянных линз. Использование электронов вместо света позволяет достичь гораздо более высокого разрешения.
За разработкой просвечивающего электронного микроскопа вскоре последовало создание сканирующего электронного микроскопа Максом Кноллем в 1935 году . [18] Хотя просвечивающие электронные микроскопы использовались для исследований до Второй мировой войны и стали популярными после нее, СЭМ не был доступен для коммерческого использования до 1965 года.
Просвечивающие электронные микроскопы стали популярными после Второй мировой войны . Эрнст Руска, работавший в Siemens , разработал первый коммерческий просвечивающий электронный микроскоп, а в 1950-х годах начали проводиться крупные научные конференции по электронной микроскопии. В 1965 году первый коммерческий сканирующий электронный микроскоп был разработан профессором сэром Чарльзом Оутли и его аспирантом Гэри Стюартом и выпущен на рынок компанией Cambridge Instrument Company под названием «Stereoscan».
Одним из последних открытий, сделанных при использовании электронного микроскопа, является возможность идентифицировать вирус. [19] Поскольку этот микроскоп дает видимое, четкое изображение мелких органелл, в электронном микроскопе нет необходимости в реагентах, чтобы увидеть вирус или вредоносные клетки, что приводит к более эффективному способу обнаружения патогенов.
С 1981 по 1983 год Герд Бинниг и Генрих Рорер работали в IBM в Цюрихе , Швейцария, над изучением явления квантового туннелирования . Они создали практический инструмент, сканирующий зондовый микроскоп из теории квантового туннелирования, который считывал очень малые силы, обмениваемые между зондом и поверхностью образца. Зонд приближается к поверхности так близко, что электроны могут непрерывно течь между зондом и образцом, создавая ток от поверхности к зонду. Первоначально микроскоп не был хорошо принят из-за сложной природы лежащих в его основе теоретических объяснений. В 1984 году Джерри Терсофф и DR Hamann, работая в Bell Laboratories компании AT&T в Мюррей-Хилл, штат Нью-Джерси, начали публиковать статьи, в которых связывали теорию с экспериментальными результатами, полученными с помощью прибора. За этим последовало в 1985 году функционирующие коммерческие приборы, а в 1986 году — изобретение Гердом Биннигом, Куэйтом и Гербером атомно -силового микроскопа , затем Нобелевская премия по физике Биннига и Рорера за SPM. [20]
Продолжается разработка новых типов сканирующих зондовых микроскопов по мере развития возможностей обработки сверхтонких зондов и наконечников.
Последние разработки в области световой микроскопии в значительной степени сосредоточены на развитии флуоресцентной микроскопии в биологии . [21] В течение последних десятилетий 20-го века, особенно в постгеномную эпоху , было разработано много методов флуоресцентного окрашивания клеточных структур. [21] Основные группы методов включают целевое химическое окрашивание определенных клеточных структур, например, химическое соединение DAPI для маркировки ДНК , использование антител, конъюгированных с флуоресцентными репортерами, см. иммунофлуоресценция , и флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок . [22] Эти методы используют эти различные флуорофоры для анализа клеточной структуры на молекулярном уровне как в живых, так и в фиксированных образцах.
Развитие флуоресцентной микроскопии привело к разработке крупной современной конструкции микроскопа — конфокального микроскопа . Принцип был запатентован в 1957 году Марвином Мински , хотя лазерная технология ограничивала практическое применение этой методики. Только в 1978 году Томас и Кристоф Кремер разработали первый практический конфокальный лазерный сканирующий микроскоп , и эта методика быстро завоевала популярность в 1980-х годах.
Многие современные исследования (в начале 21 века) в области оптических методов микроскопии сосредоточены на разработке сверхразрешающего анализа флуоресцентно меченых образцов. Структурированное освещение может улучшить разрешение примерно в два-четыре раза, а такие методы, как микроскопия с истощением стимулированного излучения (STED), приближаются к разрешению электронных микроскопов. [23] Это происходит из-за того, что дифракционный предел возникает из-за света или возбуждения, что заставляет разрешение удваиваться, чтобы стать сверхнасыщенным. Стефан Хелл был удостоен Нобелевской премии по химии 2014 года за разработку метода STED вместе с Эриком Бетцигом и Уильямом Мёрнером, которые адаптировали флуоресцентную микроскопию для визуализации отдельных молекул. [24]
Рентгеновские микроскопы — это приборы, которые используют электромагнитное излучение, как правило, в мягком рентгеновском диапазоне, для получения изображений объектов. Технологические достижения в области оптики рентгеновских линз в начале 1970-х годов сделали этот прибор жизнеспособным выбором для получения изображений. [25] Они часто используются в томографии (см. микрокомпьютерная томография ) для получения трехмерных изображений объектов, включая биологические материалы, которые не были химически зафиксированы. В настоящее время проводятся исследования по улучшению оптики для жестких рентгеновских лучей, которые имеют большую проникающую способность. [25]
Микроскопы можно разделить на несколько различных классов. Одна группа основана на том, что взаимодействует с образцом для создания изображения, т. е. свет или фотоны (оптические микроскопы), электроны (электронные микроскопы) или зонд (сканирующие зондовые микроскопы). С другой стороны, микроскопы можно классифицировать на основе того, анализируют ли они образец через точку сканирования (конфокальные оптические микроскопы, сканирующие электронные микроскопы и сканирующие зондовые микроскопы) или анализируют образец сразу (широкопольные оптические микроскопы и просвечивающие электронные микроскопы).
Широкопольные оптические микроскопы и просвечивающие электронные микроскопы используют теорию линз ( оптика для световых микроскопов и электромагнитные линзы для электронных микроскопов) для увеличения изображения, создаваемого прохождением волны , переданной через образец или отраженной образцом. Используемые волны являются электромагнитными (в оптических микроскопах ) или электронными пучками (в электронных микроскопах ). Разрешение в этих микроскопах ограничено длиной волны излучения, используемого для изображения образца, тогда как более короткие длины волн позволяют достичь более высокого разрешения. [21]
Сканирующие оптические и электронные микроскопы, такие как конфокальный микроскоп и сканирующий электронный микроскоп, используют линзы для фокусировки пятна света или электронов на образец, а затем анализируют сигналы, генерируемые лучом, взаимодействующим с образцом. Затем точка сканируется по образцу для анализа прямоугольной области. Увеличение изображения достигается путем отображения данных сканирования физически небольшой области образца на относительно большом экране. Эти микроскопы имеют тот же предел разрешения, что и широкопольные оптические, зондовые и электронные микроскопы.
Сканирующие зондовые микроскопы также анализируют одну точку в образце, а затем сканируют зонд по прямоугольной области образца для построения изображения. Поскольку эти микроскопы не используют электромагнитное или электронное излучение для получения изображения, они не подвержены тому же пределу разрешения, что и оптические и электронные микроскопы, описанные выше.
Наиболее распространенным типом микроскопа (и первым изобретенным) является оптический микроскоп . Это оптический прибор , содержащий одну или несколько линз , создающих увеличенное изображение образца, помещенного в фокальную плоскость. Оптические микроскопы имеют преломляющее стекло (иногда пластиковое или кварцевое ), чтобы фокусировать свет на глаз или на другой светоприемник. Зеркальные оптические микроскопы работают таким же образом. Типичное увеличение светового микроскопа, предполагая, что свет видимого диапазона, составляет до 1250× с теоретическим пределом разрешения около 0,250 микрометров или 250 нанометров . [21] Это ограничивает практическое увеличение до ~1500×. Специализированные методы (например, сканирующая конфокальная микроскопия , Vertico SMI ) могут превышать это увеличение, но разрешение ограничено дифракцией . Использование более коротких длин волн света, таких как ультрафиолет, является одним из способов улучшения пространственного разрешения оптического микроскопа, как и такие устройства, как сканирующий оптический микроскоп ближнего поля .
Sarfus — это новейшая оптическая технология, которая повышает чувствительность стандартного оптического микроскопа до точки, где возможно непосредственно визуализировать нанометрические пленки (до 0,3 нанометра) и изолированные нанообъекты (до 2 нм в диаметре). Технология основана на использовании неотражающих подложек для кросс-поляризованной микроскопии отраженного света.
Ультрафиолетовый свет позволяет разрешать микроскопические особенности, а также получать изображения образцов, прозрачных для глаза. Ближний инфракрасный свет может использоваться для визуализации схем, встроенных в кремниевые устройства, поскольку кремний прозрачен в этой области длин волн.
Во флуоресцентной микроскопии можно использовать множество длин волн света от ультрафиолетового до видимого диапазона, чтобы вызвать флуоресценцию образцов , что позволяет наблюдать их невооруженным глазом или с помощью специально чувствительных камер.
Фазово-контрастная микроскопия — это метод оптического микроскопического освещения, при котором небольшие фазовые сдвиги в свете, проходящем через прозрачный образец, преобразуются в изменения амплитуды или контраста на изображении. [21] Использование фазового контраста не требует окрашивания для просмотра слайда. Этот метод микроскопии позволил изучать клеточный цикл в живых клетках.
Традиционный оптический микроскоп в последнее время эволюционировал в цифровой микроскоп . В дополнение к прямому просмотру объекта через окуляры или вместо этого, для получения изображения используется тип датчика, аналогичный тем, которые используются в цифровой камере , который затем отображается на мониторе компьютера. Эти датчики могут использовать технологию КМОП или прибора с зарядовой связью (ПЗС), в зависимости от области применения.
Цифровая микроскопия с очень низким уровнем освещенности, чтобы избежать повреждения уязвимых биологических образцов, доступна с использованием чувствительных цифровых камер с подсчетом фотонов . Было продемонстрировано, что источник света, обеспечивающий пары запутанных фотонов , может минимизировать риск повреждения наиболее светочувствительных образцов. В этом применении фантомного изображения к микроскопии с разреженными фотонами образец освещается инфракрасными фотонами, каждый из которых пространственно коррелирует с запутанным партнером в видимом диапазоне для эффективного изображения камерой с подсчетом фотонов. [27]
Два основных типа электронных микроскопов — это просвечивающие электронные микроскопы (ПЭМ) и сканирующие электронные микроскопы (СЭМ). [21] [22] Они оба имеют ряд электромагнитных и электростатических линз для фокусировки пучка электронов высокой энергии на образце. В ПЭМ электроны проходят через образец, аналогично базовой оптической микроскопии . [21] Это требует тщательной подготовки образца, поскольку электроны сильно рассеиваются большинством материалов. [22] Образцы также должны быть очень тонкими (менее 100 нм), чтобы электроны могли пройти через них. [21] [22] Поперечные сечения клеток, окрашенных осмием и тяжелыми металлами, показывают прозрачные мембраны органелл и белки, такие как рибосомы. [22] С уровнем разрешения 0,1 нм можно получить подробные изображения вирусов (20–300 нм) и нити ДНК (шириной 2 нм). [22] Напротив, СЭМ имеет растровые катушки для сканирования поверхности объемных объектов тонким электронным пучком. Поэтому образец не обязательно должен быть разделен на секции, но покрытие нанометрическим слоем металла или углерода может потребоваться для непроводящих образцов. [21] СЭМ позволяет быстро получать изображения поверхности образцов, возможно, в тонком водяном паре для предотвращения высыхания. [21] [22]
Различные типы сканирующих зондовых микроскопов возникают из-за множества различных типов взаимодействий, которые происходят, когда небольшой зонд сканируется и взаимодействует с образцом. Эти взаимодействия или режимы могут быть записаны или отображены как функция местоположения на поверхности для формирования карты характеристик. Три наиболее распространенных типа сканирующих зондовых микроскопов — это атомно-силовые микроскопы (АСМ), сканирующие оптические микроскопы ближнего поля (NSOM или SNOM, сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля) и сканирующие туннельные микроскопы (СТМ). [28] Атомно-силовой микроскоп имеет тонкий зонд, обычно из кремния или нитрида кремния, прикрепленный к кантилеверу; зонд сканируется по поверхности образца, и силы, которые вызывают взаимодействие между зондом и поверхностью образца, измеряются и отображаются на карте. Сканирующий оптический микроскоп ближнего поля похож на АСМ, но его зонд состоит из источника света в оптическом волокне, покрытом наконечником, который обычно имеет отверстие для прохождения света. Микроскоп может захватывать как проходящий, так и отраженный свет для измерения очень локализованных оптических свойств поверхности, обычно биологического образца. Сканирующие туннельные микроскопы имеют металлический наконечник с одним апикальным атомом; наконечник прикреплен к трубке, по которой течет ток. [29] Наконечник сканируется по поверхности проводящего образца до тех пор, пока не потечет туннельный ток; ток поддерживается постоянным с помощью компьютерного перемещения наконечника, а изображение формируется с помощью записанных движений наконечника. [28]
Сканирующие акустические микроскопы используют звуковые волны для измерения изменений акустического импеданса. Подобно сонару в принципе, они используются для таких задач, как обнаружение дефектов в подповерхностях материалов, включая те, которые встречаются в интегральных схемах. 4 февраля 2013 года австралийские инженеры построили «квантовый микроскоп», который обеспечивает непревзойденную точность. [30]
Микроскопы с мобильным приложением могут опционально использоваться в качестве оптического микроскопа при активации фонарика. Однако микроскопы с мобильным приложением сложнее в использовании из-за визуального шума , часто ограничены 40x и ограничениями по разрешению самого объектива камеры .
