stringtranslate.com

Пероксидаза хрена

Фермент пероксидаза хрена ( HRP ), обнаруженный в корнях хрена , широко используется в биохимических приложениях. Это металлофермент со многими изоформами, из которых наиболее изученным типом является C. Он катализирует окисление различных органических субстратов перекисью водорода.

Структура

Структура фермента была впервые решена с помощью рентгеновской кристаллографии в 1997 году [2] и с тех пор была решена несколько раз с различными субстратами. [3] Это большой альфа-спиральный гликопротеин, который связывает гем в качестве окислительно-восстановительного кофактора .

Субстраты

Сам по себе фермент HRP или его конъюгаты не представляют большой ценности; его присутствие должно быть обнаружено с помощью субстрата , который при окислении HRP с использованием перекиси водорода в качестве окислителя дает характерное изменение цвета, обнаруживаемое спектрофотометрическими методами. [4] [5]

Многочисленные субстраты для пероксидазы хрена были описаны и коммерциализированы для использования желаемых свойств HRP. Эти субстраты делятся на несколько различных категорий. HRP катализирует превращение хромогенных субстратов (например, TMB , DAB , ABTS ) в окрашенные продукты и производит свет при воздействии на хемилюминесцентные субстраты (например, усиленная хемилюминесценция люминолом ). [ необходима цитата ]

Некоторые из наиболее распространенных хромогенных субстратов HRP. Люминол является исключением, так как он не является хромофором , а свет генерируется после реакции, катализируемой HRP.

Приложения

Пероксидаза хрена представляет собой гликопротеин массой 44 173,9 дальтона с шестью остатками лизина , который может быть конъюгирован с меченой молекулой. Он производит цветное, флуориметрическое [6] или люминесцентное производное меченой молекулы при инкубации с соответствующим субстратом, что позволяет его обнаружить и количественно оценить. HRP часто используется в конъюгатах (молекулах, которые были соединены генетически или химически) для определения наличия молекулярной мишени. Например, антитело, конъюгированное с HRP, может быть использовано для обнаружения небольшого количества определенного белка в вестерн-блоте . Здесь антитело обеспечивает специфичность для обнаружения интересующего белка, а фермент HRP в присутствии субстрата производит обнаруживаемый сигнал. [7] Пероксидаза хрена также широко используется в таких методах, как ИФА и иммуногистохимия, из-за ее мономерной природы и легкости, с которой она производит окрашенные продукты. Пероксидаза, гемсодержащая оксидоредуктаза, является коммерчески важным ферментом, который катализирует восстановительное расщепление перекиси водорода донором электронов.

Пероксидаза хрена идеальна во многих отношениях для этих применений, поскольку она меньше, стабильнее и менее дорогая, чем другие популярные альтернативы, такие как щелочная фосфатаза . Она также имеет высокую скорость оборота, что позволяет генерировать сильные сигналы за относительно короткий промежуток времени. [8] Высокие концентрации фосфата серьезно снижают стабильность пероксидазы хрена. Помимо биомедицинского применения, пероксидаза хрена является одним из ферментов с важными экологическими применениями. Этот фермент подходит для удаления гидроксилированных ароматических соединений (ГАС), которые считаются основными загрязнителями в самых разных промышленных сточных водах . [9]

Более того, «В последние годы метод маркировки нейронов ферментом пероксидазой хрена стал основным инструментом. За свою короткую историю этот метод, вероятно, использовался большим числом нейробиологов , чем метод Гольджи с момента его открытия в 1870 году». [10]

Усиленная хемилюминесценция

Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола до 3-аминофталата через несколько промежуточных продуктов. Реакция сопровождается испусканием света низкой интенсивности при 428 нм. В присутствии определенных химических веществ испускаемый свет усиливается до 1000 раз, что облегчает обнаружение света и повышает чувствительность реакции. Усиление испускания света называется усиленной хемилюминесценцией (ECL). Можно использовать несколько усилителей, таких как общеизвестные модифицированные фенолы (в основном йодфенол). Несколько субстратов на рынке используют другие усилители, которые приводят к сигналам люминесценции до 13 раз больше, чем у субстратов, усиленных фенолом. [11] Интенсивность света является мерой количества реагирующих молекул фермента и, следовательно, количества гибрида. ECL прост в настройке и чувствителен, обнаруживая около 0,5 пг нуклеиновой кислоты в саузерн- и нозерн-блотах . Детекция хемилюминесцентными субстратами имеет несколько преимуществ по сравнению с хромогенными субстратами. Чувствительность в 10-100 раз выше, и количественная оценка светового излучения возможна в широком динамическом диапазоне, тогда как для окрашенных осадков она гораздо более ограничена, примерно на порядок меньше. Фильтры для зачистки намного проще, когда используются хемилюминесцентные субстраты. [ необходима цитата ]

Синтез полимеров

2-Гидроксиэтил 2-бромизобутират, субстрат HRP.

Пероксидаза хрена может использоваться для различных реакций полимеризации, но наиболее изученной является полимеризация производных фенола. [12] Однако пероксидаза хрена может также использоваться в качестве катализатора для реакций радикальной полимеризации с переносом атома [13] и создавать полимеры в отсутствие перекиси водорода. В этом случае субстратом для HRP является алкилгалогенид или алкилнитрил, [14] которые являются инициаторами реакций ATRP. HRP реагирует с такими соединениями, создавая радикалы, которые начинают полимеризацию. ATRP, катализируемая HRP, обеспечивает уровень контроля над полимеризацией, сопоставимый с тем, который достигается в реакции, катализируемой металлами.

Имитирует HRP

Многие материалы были исследованы для имитации природного HRP. Например, наночастицы оксида железа и комплексы, содержащие гемин, использовались для имитации HRP. [15] Эти искусственные ферменты , подобные HRP, использовались для многих целей, начиная от обнаружения биомаркеров и иммуноокрашивания опухолей до антибиообрастания.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ PDB : 1w4w ​; Carlsson GH, Nicholls P, Svistunenko D, Berglund GI, Hajdu J (январь 2005 г.). «Комплексы пероксидазы хрена с формиатом, ацетатом и оксидом углерода». Биохимия . 44 (2): 635–42. doi :10.1021/bi0483211. PMID  15641789.
  2. ^ PDB : 1ATJ ​; Gajhede M, Schuller DJ, Henriksen A, Smith AT, Poulos TL (декабрь 1997 г.). «Кристаллическая структура пероксидазы хрена C при разрешении 2,15 А». Nature Structural Biology . 4 (12): 1032–8. doi :10.1038/nsb1297-1032. PMID  9406554. S2CID  8535268.
  3. ^ "Peroxidase C1A Related PDB sequences". UniPDB . Европейский институт биоинформатики.
  4. ^ Veitch NC (февраль 2004 г.). «Пероксидаза хрена: современный взгляд на классический фермент». Фитохимия . 65 (3): 249–59. doi :10.1016/j.phytochem.2003.10.022. PMID  14751298.
  5. ^ Akkara JA, Senecal KJ, Kaplan DL (октябрь 1991 г.). «Синтез и характеристика полимеров, полученных пероксидазой хрена в диоксане». Journal of Polymer Science . 29 (11): 1561–74. Bibcode :1991JPoSA..29.1561A. doi : 10.1002/pola.1991.080291105 .
  6. ^ Acharya AP, Nafisi PM, Gardner A, MacKay JL, Kundu K, Kumar S, Murthy N (2013). «Флуоресцентный пероксидазный зонд увеличивает чувствительность коммерческих ИФА на два порядка». Chem Commun . 49 (88): 10379–10381. doi :10.1039/c3cc44783a. PMC 4011665. PMID  24071916 . 
  7. ^ Чау YP, Лу KS (1995). «Исследование свойств барьера между кровью и ганглиозными сосудами в симпатических ганглиях крыс с использованием ионов лантана и пероксидазы хрена в качестве трассеров». Acta Anatomica . 153 (2): 135–44. doi :10.1159/000313647. PMID  8560966.
  8. ^ Бейзави К, Хэмптон С, Квасовски П, Фиклинг С, Маркс В, Клифт Р (март 1987). «Сравнение пероксидазы хрена и меченных щелочной фосфатазой антител в иммуноферментных анализах». Annals of Clinical Biochemistry . 24 (Pt 2) (2): 145–52. doi : 10.1177/000456328702400204 . PMID  3035992. S2CID  40978557.
  9. ^ Ghasempur S, Torabi SF, Ranaei-Siadat SO, Jalali-Heravi M, Ghaemi N, Khajeh K (октябрь 2007 г.). «Оптимизация процесса окислительной связи, катализируемого пероксидазой, для удаления фенола из сточных вод с использованием методологии поверхности отклика». Environmental Science & Technology . 41 (20): 7073–9. Bibcode : 2007EnST...41.7073G. doi : 10.1021/es070626q. PMID  17993150.
  10. ^ Lichtman JW, Purves D (1985). "Клеточная маркировка пероксидазой хрена". Принципы развития нейронов. Сандерленд, Массачусетс: Sinauer Associates. стр. 114. ISBN 978-0-87893-744-8.
  11. ^ Субстрат для высокоинтенсивного HRP-хемилюминесценции ELISA Архивировано 08.04.2016 на Wayback Machine . Haemoscan.com (11.02.2016). Получено 29.03.2016.
  12. ^ Лопес, Гвидо Р.; Пинто, Диана CGA; Сильва, Артур MS (2014). «Пероксидаза хрена (HRP) как инструмент в зеленой химии». RSC Advances . 4 (70): 37244–37265. doi :10.1039/C4RA06094F.
  13. ^ Sigg, Severin J.; Seidi, Farzad; Renggli, Kasper; Silva, Tilana B.; Kali, Gergely; Bruns, Nico (ноябрь 2011 г.). «Пероксидаза хрена как катализатор радикальной полимеризации с переносом атома». Macromolecular Rapid Communications . 32 (21): 1710–1715. doi :10.1002/marc.201100349. ISSN  1022-1336.
  14. ^ Нг, Йип-Хунг; Лена, Фабио ди; Чай, Кристина ЛЛ (2011-05-24). «PolyPEGA с предопределенными молекулярными массами из ферментативно-опосредованной радикальной полимеризации в воде». Chemical Communications . 47 (22): 6464–6466. doi :10.1039/C1CC10989H. ISSN  1364-548X.
  15. ^ Wei H, Wang E (июль 2013 г.). «Наноматериалы с ферментоподобными характеристиками (нанозимы): искусственные ферменты следующего поколения». Chemical Society Reviews . 42 (14): 6060–93. doi :10.1039/C3CS35486E. PMID  23740388.

Внешние ссылки