Покрытие (генетика)

Перекрытие продукта трех циклов секвенирования с указанием покрытия считываемой последовательности в каждой точке.

В генетике покрытие является одним из нескольких показателей глубины или полноты секвенирования ДНК и более конкретно выражается в любом из следующих терминов:

• Покрытие последовательности (или глубина) — это количество уникальных прочтений, которые включают данный нуклеотид в реконструированную последовательность. ^{[1] [2]} Глубокое секвенирование относится к общей концепции стремления к большому количеству уникальных прочтений каждой области последовательности. ^[3]
• Физическое покрытие — совокупная длина чтений или пар чтений, выраженная как кратное размеру генома. ^[4]
• Геномное покрытие — процент всех пар оснований или локусов генома, охваченных секвенированием.

Покрытие последовательности

Обоснование

Несмотря на то, что точность секвенирования каждого отдельного нуклеотида очень высока, очень большое количество нуклеотидов в геноме означает, что если отдельный геном секвенировать только один раз, возникнет значительное количество ошибок секвенирования. Более того, многие позиции генома содержат редкие однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Следовательно, чтобы отличить ошибки секвенирования от истинных SNP, необходимо еще больше повысить точность секвенирования за счет секвенирования отдельных геномов большое количество раз.

Сверхглубокое секвенирование

Термин «сверхглубокий» иногда также может относиться к более высокому охвату (> 100-кратному), что позволяет обнаруживать варианты последовательностей в смешанных популяциях. ^{[5] [6] [7]} В крайнем случае, подходы секвенирования с коррекцией ошибок, такие как секвенирование максимальной глубины, могут сделать так, что охват заданной области приближается к пропускной способности секвенатора, обеспечивая покрытие> 10 ^ 8. ^[8]

Секвенирование транскриптома

Глубокое секвенирование транскриптомов , также известное как RNA-Seq , обеспечивает как последовательность, так и частоту молекул РНК, которые присутствуют в любой конкретный момент времени в определенном типе клеток, ткани или органе. ^[9] Подсчет количества мРНК, кодируемых отдельными генами, является индикатором потенциала кодирования белка, что является основным фактором, влияющим на фенотип . ^[10] Совершенствование методов секвенирования РНК является активной областью исследований как с точки зрения экспериментальных, так и вычислительных методов. ^[11]

Расчет

Среднее покрытие для всего генома можно рассчитать на основе длины исходного генома ( G ), количества чтений ( N ) и средней длины чтения ( L ) как . Например, гипотетический геном с 2000 парами оснований, реконструированный из 8 ридов со средней длиной 500 нуклеотидов, будет иметь 2-кратную избыточность. Этот параметр также позволяет оценить другие величины, такие как процент генома, охваченного чтениями (иногда его также называют широтой охвата). Желателен широкий охват последовательности дробовиков, поскольку это может устранить ошибки в вызове и сборке баз. Предмет теории секвенирования ДНК касается взаимоотношений таких величин. ^[2] ${\textstyle N\times L/G}$

Физическое покрытие

Иногда проводится различие между последовательным покрытием и физическим покрытием . Если покрытие последовательности представляет собой среднее количество раз считывания основания, то физическое покрытие представляет собой среднее количество раз, когда основание считывается или охватывается парными чтениями. ^{[2] [12] [4]}

Геномный охват

С точки зрения геномного охвата и точности полногеномное секвенирование можно в общих чертах разделить на одно из следующих: ^[13]

• Черновой вариант последовательности , охватывающий примерно 90% генома с точностью примерно 99,9%.
• Готовая последовательность , охватывающая более 95% генома с точностью примерно 99,99%.

Производство по-настоящему качественного готового эпизода по этому определению обходится очень дорого. Таким образом, большинство результатов « полного секвенирования генома » человека представляют собой черновые последовательности (иногда выше, а иногда ниже точности, определенной выше). ^[13]

Рекомендации

1. «Охват секвенирования». Illumina.com . Образование Иллюмина . Проверено 8 октября 2020 г.
2. Симс, Дэвид; Садбери, Ян; Илотт, Николас Э.; Хегер, Андреас; Понтинг, Крис П. (2014). «Глубина и охват секвенирования: ключевые аспекты геномного анализа». Обзоры природы Генетика . 15 (2): 121–132. дои : 10.1038/nrg3642. PMID  24434847. S2CID  13325739.
3. Мардис, Элейн Р. (1 сентября 2008 г.). «Методы секвенирования ДНК нового поколения». Ежегодный обзор геномики и генетики человека . 9 (1): 387–402. дои : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164359. ISSN  1527-8204. ПМИД  18576944.
4. Экблом, Роберт; Вольф, Йохен Б.В. (2014). «Полевое руководство по полногеномному секвенированию, сборке и аннотированию». Эволюционные приложения . 7 (9): 1026–42. дои : 10.1111/eva.12178. ПМЦ 4231593 . ПМИД  25553065. 
5. Аджай СС, Паркер СК, Абаан Х.О., Фахардо КВ, Маргулис Э.Х. (сентябрь 2011 г.). «Точное и комплексное секвенирование личных геномов». Геном Рез . 21 (9): 1498–505. дои : 10.1101/гр.123638.111. ПМК 3166834 . ПМИД  21771779. 
6. Миребрагим, Хамид; Клоуз, Тимоти Дж.; Лонарди, Стефано (15 июня 2015 г.). «Мета-сборка данных сверхглубокого секвенирования de novo». Биоинформатика . 31 (12): i9–i16. doi : 10.1093/биоинформатика/btv226. ISSN  1367-4803. ПМЦ 4765875 . ПМИД  26072514. 
7. Беренвинкель, Нико ; Загорди, Освальдо (1 ноября 2011 г.). «Сверхглубокое секвенирование для анализа вирусных популяций». Современное мнение в вирусологии . 1 (5): 413–418. дои : 10.1016/j.coviro.2011.07.008. ПМИД  22440844.
8. Джи, Дж.; Расули, А.; Шамовский И.; Акивис, Ю.; Штейнман, С.; Мишра, Б.; Нудлер, Э. (2016). «Скорость и механизмы бактериального мутагенеза при секвенировании максимальной глубины». Природа . 534 (7609): 693–696. Бибкод : 2016Natur.534..693J. дои : 10.1038/nature18313. ПМЦ 4940094 . ПМИД  27338792. 
9. Мэлоун, Джон Х.; Оливер, Брайан (1 января 2011 г.). «Микрочипы, глубокое секвенирование и истинная оценка транскриптома». БМК Биология . 9:34 . дои : 10.1186/1741-7007-9-34 . ISSN  1741-7007. ПМК 3104486 . ПМИД  21627854. 
10. Хэмптон М., Мелвин Р.Г., Кендалл А.Х., Киркпатрик Б.Р., Петерсон Н., Эндрюс М.Т. (2011). «Глубокое секвенирование транскриптома выявляет сезонные адаптивные механизмы у млекопитающих, находящихся в спячке». ПЛОС ОДИН . 6 (10): e27021. Бибкод : 2011PLoSO...627021H. дои : 10.1371/journal.pone.0027021 . ПМК 3203946 . ПМИД  22046435. 
11. Хейер Э.Э., Озадам Х., Риччи Э.П., Ченик С., Мур М.Дж. (2015). «Оптимизированный метод без наборов для создания библиотек глубокого секвенирования, специфичных для цепей, из фрагментов РНК». Нуклеиновые кислоты Рез . 43 (1): e2. дои : 10.1093/nar/gku1235. ПМЦ 4288154 . ПМИД  25505164. 
12. Мейерсон, М.; Габриэль, С.; Гетц, Г. (2010). «Достижения в понимании геномов рака посредством секвенирования второго поколения». Обзоры природы Генетика . 11 (10): 685–696. дои : 10.1038/nrg2841. PMID  20847746. S2CID  2544266.
13. Крис А. Веттерстранд, MS «Стоимость секвенирования генома человека». Национальный институт исследования генома человека .Последнее обновление: 1 ноября 2021 г.