Праймер — это короткая одноцепочечная нуклеиновая кислота , используемая всеми живыми организмами для инициации синтеза ДНК . Синтетический праймер также может называться « олиго» , сокращенно от « олигонуклеотид». Ферменты ДНК-полимеразы (отвечающие за репликацию ДНК) способны добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей нуклеиновой кислоты, поэтому требуется, чтобы праймер был связан с матрицей, прежде чем ДНК-полимераза сможет начать комплементарную цепь. [1] ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды после связывания с праймером РНК и синтезирует всю цепь. Позже нити РНК необходимо аккуратно удалить и заменить их нуклеотидами ДНК, образующими область разрыва, известную как разрыв, который заполняется с помощью фермента, называемого лигазой. [2] Для процесса удаления РНК-праймера требуется несколько ферментов, таких как Fen1, Lig1 и другие, которые работают в координации с ДНК-полимеразой, чтобы обеспечить удаление нуклеотидов РНК и добавление нуклеотидов ДНК. В живых организмах используются исключительно праймеры РНК, тогда как лабораторные методы биохимии и молекулярной биологии , требующие синтеза ДНК in vitro (например, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция ), обычно используют праймеры ДНК, поскольку они более стабильны к температуре. Праймеры могут быть разработаны в лаборатории для конкретных реакций, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). При разработке праймеров для ПЦР необходимо учитывать определенные параметры, такие как температура плавления праймеров и температура отжига самой реакции. Более того, ДНК-связывающая последовательность праймера in vitro должна быть специально выбрана, что делается с использованием метода, называемого инструментом поиска базового локального выравнивания (BLAST), который сканирует ДНК и находит специфические и уникальные области для связывания праймера.
Праймеры РНК используются живыми организмами для инициации синтеза цепи ДНК . Класс ферментов, называемых примазами , добавляет комплементарный праймер РНК к матрице чтения de novo как на ведущей , так и на отстающей цепи . Начиная со свободного 3'-ОН праймера, известного как конец праймера, ДНК-полимераза может удлинить вновь синтезированную цепь. Ведущая цепь при репликации ДНК синтезируется одним непрерывным куском, перемещающимся вместе с репликационной вилкой , и для начала синтеза требуется только начальный праймер РНК. В отстающей цепи ДНК-матрица движется в направлении 5’→3’ . Поскольку ДНК-полимераза не может добавлять основания в направлении 3'→5', комплементарные цепи матрицы, ДНК синтезируется «обратно» в виде коротких фрагментов, удаляющихся от репликационной вилки, известных как фрагменты Оказаки . В отличие от ведущей цепи, этот метод приводит к многократному запуску и остановке синтеза ДНК, что требует наличия нескольких праймеров для РНК. Вдоль матрицы ДНК примаза вкрапляет РНК-праймеры, которые ДНК-полимераза использует для синтеза ДНК, в направлении 5'→3'. [1]
Другим примером праймеров, используемых для синтеза ДНК, является обратная транскрипция . Обратная транскриптаза — это фермент, который использует матричную цепь РНК для синтеза комплементарной цепи ДНК. ДНК-полимеразный компонент обратной транскриптазы требует наличия существующего 3'-конца для начала синтеза. [1]
После вставки фрагментов Оказаки праймеры РНК удаляются (механизм удаления у прокариот и эукариот различается ) и заменяются новыми дезоксирибонуклеотидами , которые заполняют пробелы там, где присутствовал праймер РНК. Затем ДНК-лигаза соединяет фрагментированные цепи вместе, завершая синтез отстающей цепи. [1]
У прокариот ДНК-полимераза I синтезирует фрагмент Оказаки до тех пор, пока он не достигнет предыдущего праймера РНК. Затем фермент одновременно действует как 5'→3'-экзонуклеаза , удаляя рибонуклеотиды праймера спереди и добавляя дезоксирибонуклеотиды сзади. Как активность полимеризации, так и удаление праймера РНК происходят в направлении 5'→3' , и полимераза I может выполнять эти действия одновременно; это известно как «Перевод Ника». [3] Трансляция Nick относится к синхронизированной активности полимеразы I при удалении праймера РНК и добавлении дезоксирибонуклеотидов . Позже между нитями образуется разрыв, называемый разрывом, который закрывается с помощью ДНК-лигазы .
У эукариот удаление праймеров РНК в отстающей цепи необходимо для завершения репликации. Таким образом, по мере синтеза отстающей цепи ДНК-полимеразой δ в направлении 5'→3' образуются фрагменты Оказаки , представляющие собой прерывистые цепи ДНК. Затем, когда ДНК-полимераза достигает 5'-конца праймера РНК из предыдущего фрагмента Оказаки, она смещает 5'-конец праймера в одноцепочечный лоскут РНК, который удаляется путем расщепления нуклеазой. Расщепление лоскутов РНК включает три метода удаления праймера. [4] Первая возможность удаления праймера заключается в создании короткого лоскута, который непосредственно удаляется эндонуклеазой 1, специфичной для структуры лоскута (FEN-1), которая расщепляет нависающий 5' лоскут. Этот метод известен как путь удаления праймера РНК с помощью короткого лоскута. [5] Второй способ расщепления праймера РНК — это разрушение цепи РНК с помощью РНКазы , у эукариот она известна как РНКаза H2. Этот фермент разрушает большую часть отожженного праймера РНК, за исключением нуклеотидов, близких к 5'-концу праймера. Таким образом, оставшиеся нуклеотиды отображаются в лоскуте, который отщепляется с помощью FEN-1. Последний возможный метод удаления праймера РНК известен как путь длинного лоскута. [5] На этом пути задействовано несколько ферментов, которые удлиняют праймер РНК, а затем отщепляют его. Лоскуты удлинены 5'-3'- хеликазой , известной как Pif1 . После добавления нуклеотидов к лоскуту с помощью Pif1 длинный лоскут стабилизируется репликационным белком А (RPA). ДНК, связанная с RPA, ингибирует активность или рекрутирование FEN1, в результате чего для расщепления лоскута должна быть задействована другая нуклеаза. [4] Эта вторая нуклеаза представляет собой ДНК2-нуклеазу , которая обладает геликазно-нуклеазной активностью, которая расщепляет длинный лоскут РНК-праймера, который затем оставляет после себя пару нуклеотидов, расщепляемых FEN1. В конце концов, когда все праймеры РНК удалены, между фрагментами Оказаки образуются разрывы , которые заполняются дезоксирибонуклеотидами с помощью фермента, известного как лигаза1 , посредством процесса, называемого лигированием .
Синтетические праймеры, иногда называемые олигонуклеотидами, представляют собой химически синтезированные олигонуклеотиды , обычно состоящие из ДНК, которые можно настроить для отжига с определенным участком ДНК-матрицы. В растворе праймер спонтанно гибридизуется с матрицей посредством спаривания оснований Уотсона-Крика, а затем удлиняется ДНК-полимеразой. Возможность создавать и настраивать синтетические праймеры оказалась бесценным инструментом, необходимым для различных молекулярно-биологических подходов, включающих анализ ДНК. И метод терминации цепи Сэнгера , и метод секвенирования ДНК « Next-Gen » требуют праймеров для инициации реакции. [1]
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) использует пару индивидуальных праймеров для направления удлинения ДНК друг к другу на противоположных концах амплифицированной последовательности. Эти праймеры обычно имеют длину от 18 до 24 оснований и должны кодировать только определенные участки выше и ниже амплифицированной последовательности. Праймер, который может связываться с несколькими участками ДНК, амплифицирует их все, устраняя необходимость ПЦР. [1]
При разработке пары праймеров для ПЦР необходимо учитывать несколько критериев. Пары праймеров должны иметь одинаковые температуры плавления, поскольку отжиг во время ПЦР происходит для обеих цепей одновременно, и эта общая температура плавления не должна быть слишком выше или ниже температуры отжига реакции . Праймер с T m (температурой плавления), намного превышающей температуру реакции отжига, может вызвать неправильную гибридизацию и распространиться в неправильном месте последовательности ДНК. A T m, значительно ниже температуры отжига, может вообще не отжечься и не растянуться.
Кроме того, необходимо выбирать последовательности праймеров для уникального отбора участка ДНК, избегая возможности гибридизации с соседней аналогичной последовательностью. Обычно используемым методом выбора сайта праймера является поиск BLAST , при котором можно увидеть все возможные области, с которыми может связываться праймер. Для поиска BLAST можно использовать как нуклеотидную последовательность, так и сам праймер. Бесплатный инструмент NCBI Primer-BLAST объединяет разработку праймеров и поиск BLAST в одном приложении [6] , как и коммерческие программные продукты, такие как ePrime и Beacon Designer . Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера путем определения температур плавления и отжига и т. д. [7]
По состоянию на 2014 год бесплатно доступно множество онлайн-инструментов для разработки праймеров, некоторые из которых ориентированы на конкретные применения ПЦР. Праймеры с высокой специфичностью к подмножеству ДНК-матриц при наличии множества подобных вариантов могут быть созданы с использованием некоторого программного обеспечения (например, DECIPHER [8] ) или разработаны независимо для конкретной группы животных. [9]
Выбор конкретной области ДНК для связывания праймера требует некоторых дополнительных соображений. Следует избегать областей с высоким содержанием мононуклеотидных и динуклеотидных повторов, поскольку может произойти образование петель, что будет способствовать несгибридизации. Праймеры не должны легко отжигаться с другими праймерами в смеси; это явление может привести к образованию продуктов «праймерных димеров», загрязняющих конечный раствор. Праймеры также не должны сильно отжигаться сами по себе, поскольку внутренние шпильки и петли могут препятствовать отжигу с матричной ДНК.
При разработке праймеров к задним концам каждого праймера можно добавлять дополнительные нуклеотидные основания, что приводит к созданию индивидуальной кэп-последовательности на каждом конце амплифицированной области. Одним из применений этой практики является использование TA-клонирования , специального метода субклонирования, аналогичного ПЦР, эффективность которого можно повысить путем добавления AG-хвостов к 5'- и 3'-концам. [10]
В некоторых ситуациях может потребоваться использование вырожденных праймеров. Это смеси праймеров, схожих, но не идентичных. Это может быть удобно при амплификации одного и того же гена из разных организмов , поскольку последовательности, вероятно, похожи, но не идентичны. Этот метод полезен, поскольку сам генетический код является вырожденным , то есть несколько разных кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту . Это позволяет разным организмам иметь существенно различающуюся генетическую последовательность, кодирующую очень похожий белок. По этой причине вырожденные праймеры также используются, когда конструкция праймеров основана на последовательности белка , поскольку конкретная последовательность кодонов неизвестна. Следовательно, последовательность праймера, соответствующая аминокислоте изолейцин, может быть «ATH», где A означает аденин , T — тимин , а H — аденин , тимин или цитозин , в соответствии с генетическим кодом каждого кодона , используя символы IUPAC для обозначения вырожденные основания . Вырожденные праймеры могут не идеально гибридизоваться с целевой последовательностью, что может значительно снизить специфичность ПЦР-амплификации.
Вырожденные праймеры широко используются и чрезвычайно полезны в области микробной экологии . Они позволяют амплифицировать гены еще некультивируемых микроорганизмов или позволяют извлекать гены из организмов, для которых геномная информация недоступна. Обычно вырожденные праймеры создаются путем выравнивания последовательности генов, найденной в GenBank . Различия между последовательностями учитываются с помощью вырождения IUPAC для отдельных оснований. Затем синтезируют праймеры для ПЦР в виде смеси праймеров, соответствующих всем перестановкам последовательности кодонов.
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )