Димер праймера ( PD ) является потенциальным побочным продуктом в полимеразной цепной реакции (ПЦР), распространенном биотехнологическом методе. Как следует из названия, PD состоит из двух молекул праймера , которые прикрепились ( гибридизировались ) друг к другу из-за цепочек комплементарных оснований в праймерах. В результате ДНК-полимераза амплифицирует PD, что приводит к конкуренции за реагенты ПЦР, тем самым потенциально ингибируя амплификацию последовательности ДНК , предназначенной для амплификации ПЦР. В количественной ПЦР PD могут мешать точной количественной оценке.
Димер праймера формируется и амплифицируется в три этапа. На первом этапе два праймера отжигаются на своих соответствующих 3'-концах (этап I на рисунке). Если эта конструкция достаточно стабильна, ДНК-полимераза свяжет и удлинит праймеры в соответствии с комплементарной последовательностью (этап II на рисунке). Важным фактором, способствующим стабильности конструкции на этапе I, является высокое содержание GC на 3'-концах и длина перекрытия. Третий этап происходит в следующем цикле, когда одна цепь продукта этапа II используется в качестве матрицы, с которой отжигаются свежие праймеры, что приводит к синтезу большего количества продукта PD. [1]
Димеры праймеров могут быть видны после гель-электрофореза продукта ПЦР. PD в гелях, окрашенных бромистым этидием , обычно видны как полоса из 30-50 пар оснований (пн) или размытие умеренной или высокой интенсивности, отличимые от полосы целевой последовательности, которая обычно длиннее 50 пн.
В количественной ПЦР PD могут быть обнаружены с помощью анализа кривой плавления с интеркалирующими красителями, такими как SYBR Green I , неспецифический краситель для обнаружения двухцепочечной ДНК. Поскольку они обычно состоят из коротких последовательностей, PD денатурируют при более низкой температуре, чем целевая последовательность, и, следовательно, их можно отличить по характеристикам кривой плавления.
Один из подходов к предотвращению PD состоит в физико-химической оптимизации системы ПЦР, т. е. изменении концентраций праймеров, хлорида магния , нуклеотидов , ионной силы и температуры реакции. Этот метод несколько ограничен физико-химическими характеристиками, которые также определяют эффективность амплификации целевой последовательности в ПЦР. Поэтому уменьшение образования PD также может привести к снижению эффективности ПЦР. Чтобы преодолеть это ограничение, другие методы направлены только на уменьшение образования PD, включая дизайн праймеров и использование различных систем ферментов ПЦР или реагентов. [ необходима цитата ]
Программное обеспечение для проектирования праймеров использует алгоритмы, которые проверяют потенциал формирования вторичной структуры ДНК и отжига праймеров с самим собой или в пределах пар праймеров. Физические параметры, которые принимаются во внимание программным обеспечением, - это потенциальная самокомплементарность и содержание GC праймеров; схожие температуры плавления праймеров; и отсутствие вторичных структур, таких как стебель-петли , в целевой последовательности ДНК. [2]
Поскольку праймеры разработаны так, чтобы иметь низкую комплементарность друг к другу, они могут отжигаться (шаг I на рисунке) только при низкой температуре, например, при комнатной температуре, например, во время приготовления реакционной смеси. Хотя ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, наиболее активны около 70 °C, они обладают некоторой полимеризующей активностью также при более низких температурах, что может вызвать синтез ДНК из праймеров после отжига друг к другу. [3] Было разработано несколько методов для предотвращения образования ПД до тех пор, пока реакция не достигнет рабочей температуры (60-70 °C), и они включают начальное ингибирование ДНК-полимеразы или физическое разделение компонентов реакции до тех пор, пока реакционная смесь не достигнет более высоких температур. Эти методы называются ПЦР с горячим стартом .
Воск : в этом методе фермент пространственно отделен от реакционной смеси воском, который плавится, когда реакция достигает высокой температуры. [4]
Медленное высвобождение магния : ДНК-полимеразе для активности требуются ионы магния, [5] поэтому магний химически отделяется от реакции путем связывания с химическим соединением и высвобождается в раствор только при высокой температуре [6]
Нековалентное связывание ингибитора : в этом методе пептид , антитело [7] или аптамер [8] нековалентно связываются с ферментом при низкой температуре и ингибируют его активность. После инкубации в течение 1–5 минут при 95 °C ингибитор высвобождается и реакция начинается.
Чувствительная к холоду Taq-полимераза : это модифицированная ДНК-полимераза, практически не проявляющая активности при низкой температуре. [9]
Химическая модификация : в этом методе небольшая молекула ковалентно связывается с боковой цепью аминокислоты в активном центре ДНК-полимеразы. Небольшая молекула высвобождается из фермента путем инкубации реакционной смеси в течение 10–15 минут при 95 °C. После высвобождения небольшой молекулы фермент активируется. [ 10]
Другой подход к предотвращению или уменьшению образования PD заключается в модификации праймеров таким образом, чтобы отжиг между собой или друг с другом не приводил к удлинению.
HANDS ( H omo-Tag Assisted Non- Dimer S ystem [ 11] ): нуклеотидный хвост, комплементарный 3'-концу праймера, добавляется к 5'-концу праймера. Из-за близкого расположения 5' - хвоста он отжигается с 3'-концом праймера. Результатом является праймер типа «стебель-петля» , который исключает отжиг, включающий более короткие перекрытия, но допускает отжиг праймера до его полностью комплементарной последовательности в мишени.
Химерные праймеры : некоторые основания ДНК в праймере заменяются основаниями РНК, создавая химерную последовательность . Температура плавления химерной последовательности с другой химерной последовательностью ниже, чем у химерной последовательности с ДНК. Это различие позволяет устанавливать температуру отжига таким образом, что праймер будет отжигаться со своей целевой последовательностью, но не с другими химерными праймерами. [12]
Блокированные расщепляемые праймеры : метод, известный как РНКаза H-зависимая ПЦР (рПЦР), [13] использует термостабильную РНКазу HII для удаления блокирующей группы из праймеров ПЦР при высокой температуре. Этот фермент РНКаза HII практически не проявляет активности при низкой температуре, что делает удаление блока возможным только при высокой температуре. Фермент также обладает свойственной дискриминацией несоответствия праймера и шаблона, что приводит к дополнительному отбору против димеров праймеров.
Самоизбегающие молекулярные системы распознавания : также известные как SAMRS, [14] устраняющие димеры праймеров путем введения в праймер аналогов нуклеотидов T*, A*, G* и C*. ДНК SAMRS может связываться с естественной ДНК, но не с другими членами того же вида SAMRS. Например, T* может связываться с A, но не с A*, а A* может связываться с T, но не с T*. Таким образом, благодаря тщательному проектированию [15] праймеры, созданные на основе SAMRS, могут избегать взаимодействия праймер-праймер и обеспечивать чувствительное обнаружение SNP, а также мультиплексную ПЦР.
В то время как методы, описанные выше, предназначены для уменьшения образования PD, другой подход направлен на минимизацию сигнала, генерируемого PD в количественной ПЦР . Этот подход полезен, пока образуется мало PD и их ингибирующее действие на накопление продукта незначительно.
Четырехшаговая ПЦР : используется при работе с неспецифическими красителями, такими как SYBR Green I. Она основана на разной длине и, следовательно, разной температуре плавления PD и целевой последовательности. В этом методе сигнал получается ниже температуры плавления целевой последовательности, но выше температуры плавления PD. [16]
Зонды, специфичные к последовательности : зонды TaqMan и молекулярные маяки генерируют сигнал только в присутствии целевой (комплементарной) последовательности, и эта повышенная специфичность исключает получение сигнала (но не возможное ингибирующее воздействие на накопление продукта) от ПД.
"Онлайн-программное обеспечение для прогнозирования димеров праймеров". OligoAnalyzer 3.1 . Интегрированные ДНК-технологии .
«Конструкция праймера. Что такое праймер-димер?». Видео на YouTube . 3 ноября 2013 г. Архивировано из оригинала 2021-12-20.