stringtranslate.com

Cre-рекомбиназа

Cre-рекомбиназа — это фермент тирозиновой рекомбиназы, полученный из бактериофага P1 . Фермент использует механизм, подобный топоизомеразе I, для осуществления событий сайт-специфической рекомбинации . Фермент (38 кДа) является членом семейства интеграз сайт-специфической рекомбиназы и, как известно, катализирует событие сайт-специфической рекомбинации между двумя сайтами распознавания ДНК ( сайты LoxP ). Этот сайт распознавания loxP из 34 пар оснований (п. н.) состоит из двух палиндромных последовательностей по 13 п. н. , которые фланкируют спейсерную область из 8 п. н. Продукты Cre-опосредованной рекомбинации на сайтах loxP зависят от местоположения и относительной ориентации сайтов loxP. Два отдельных вида ДНК, оба содержащие сайты loxP, могут подвергаться слиянию в результате Cre-опосредованной рекомбинации. Последовательности ДНК, обнаруженные между двумя сайтами loxP, называются « флоксированными ». В этом случае продукты рекомбинации, опосредованной Cre, зависят от ориентации сайтов loxP. ДНК, обнаруженная между двумя сайтами loxP, ориентированными в одном направлении, будет вырезана в виде кольцевой петли ДНК, в то время как промежуточная ДНК между двумя сайтами loxP, ориентированными в противоположных направлениях, будет инвертирована. [1] Фермент не требует дополнительных кофакторов (таких как АТФ ) или вспомогательных белков для своей функции. [2]

Фермент играет важную роль в жизненном цикле бактериофага P1, например, в циклизации линейного генома и разделении димерных хромосом , которые образуются после репликации ДНК . [3]

Рекомбиназа Cre является широко используемым инструментом в области молекулярной биологии . Уникальная и специфическая система рекомбинации фермента используется для манипулирования генами и хромосомами в огромном диапазоне исследований, таких как исследования по выключению или включению генов . Способность фермента эффективно работать в широком диапазоне клеточных сред (включая млекопитающих, растения, бактерии и дрожжи) позволяет использовать систему рекомбинации Cre-Lox в огромном количестве организмов, что делает ее особенно полезным инструментом в научных исследованиях. [4]

Открытие

Исследования, проведенные в 1981 году Штернбергом и Гамильтоном, продемонстрировали, что бактериофаг « P1 » имел уникальную систему сайт-специфической рекомбинации. Фрагменты EcoRI генома бактериофага P1 были получены и клонированы в лямбда-векторы . Было обнаружено, что фрагмент EcoRI размером 6,5 кб (фрагмент 7) допускает эффективные события рекомбинации. [5] Механизм этих событий рекомбинации был известен как уникальный, поскольку они происходили в отсутствие бактериальных белков RecA и RecBCD . Компоненты этой системы рекомбинации были выяснены с помощью исследований делеционного мутагенеза . Эти исследования показали, что для эффективных событий рекомбинации требуются как продукт гена P1, так и сайт рекомбинации. Продукт гена P1 был назван Cre ( c yclization re combination), а сайт рекомбинации был назван loxP ( locus of crossing ( x ) over, P 1). [5] Белок Cre был очищен в 1983 году и, как было установлено, представляет собой белок массой 35 000 Да. [2] Для рекомбиназной активности очищенного белка не требуются высокоэнергетические кофакторы, такие как АТФ или вспомогательные белки. [2] Ранние исследования также продемонстрировали, что Cre связывается с неспецифическими последовательностями ДНК, имея при этом в 20 раз более высокую аффинность к последовательностям loxP, а результаты ранних исследований футпринтинга ДНК также предполагают, что молекулы Cre связывают сайты loxP как димеры . [2]

Мультипликационная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Вид сбоку
Мультипликационная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим цветом, а карбоксильный домен — зеленым. (Вид сбоку)
Мультипликационная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Вид сверху
Мультипликационная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим цветом, а карбоксильный домен — зеленым. (Вид головы)

Структура

Рекомбиназа Cre состоит из 343 аминокислот , которые образуют два отдельных домена. Аминоконцевой домен охватывает остатки 20–129, и этот домен содержит 5 альфа-спиральных сегментов, связанных серией коротких петель. Спирали A и E участвуют в образовании тетрамера рекомбиназы, при этом известно, что C-концевая область спирали E образует контакты с C-концевым доменом соседних субъединиц. Спирали B и D образуют прямые контакты с большой бороздкой ДНК loxP. Считается, что эти две спирали образуют три прямых контакта с основаниями ДНК на участке loxP. Карбоксиконцевой домен фермента состоит из аминокислот 132–341 и содержит активный центр фермента. Общая структура этого домена имеет большое структурное сходство с каталитическим доменом других ферментов того же семейства, таких как λ-интеграза и HP1-интеграза. Этот домен преимущественно спиральный по структуре с 9 отдельными спиралями (F−N). Концевая спираль (N) выступает из основного тела карбокси-домена, и эта спираль, как полагают, играет роль в посредничестве взаимодействий с другими субъединицами. Кристаллические структуры показывают, что эта конечная спираль N зарывает свою гидрофобную поверхность в акцепторный карман соседней субъединицы Cre. [6]

Эффект двухдоменной структуры заключается в формировании С-образного зажима, который захватывает ДНК с противоположных сторон. [3]

Активный сайт

Карикатурная модель активного центра рекомбиназы Cre. Фермент связан со своим субстратом (ДНК).
Эта мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК), показывает аминокислоты, вовлеченные в активный сайт, красным цветом и помеченные. Это изображение получено после расщепления ДНК.

Активный центр фермента Cre состоит из консервативных остатков каталитической триады Arg 173, His 289, Arg 292, а также консервативных нуклеофильных остатков Tyr 324 и Trp 315. В отличие от некоторых ферментов рекомбиназы, таких как рекомбиназа Flp, Cre не образует общего активного центра между отдельными субъединицами, и все остатки, которые вносят вклад в активный центр, находятся на одной субъединице. Следовательно, когда две молекулы Cre связываются с одним сайтом loxP, присутствуют два активных центра. Рекомбинация, опосредованная Cre, требует образования синапса, в котором два комплекса Cre-LoxP ассоциируются, образуя то, что известно как тетрамер синапса, в котором присутствуют 4 различных активных центра. [6] Tyr 324 действует как нуклеофил , образуя ковалентную 3'-фосфотирозиновую связь с субстратом ДНК. Разрезной фосфат (фосфат, нацеленный на нуклеофильную атаку в месте расщепления) координируется боковыми цепями 3 аминокислотных остатков каталитической триады ( Arg 173, His 289 и Trp 315). Азот индола триптофана 315 также образует водородную связь с этим разрезным фосфатом. (примечание: гистидин занимает этот сайт в других членах семейства тирозиновых рекомбиназ и выполняет ту же функцию). Эта реакция расщепляет ДНК и освобождает 5'-гидроксильную группу. Этот процесс происходит в активном центре двух из четырех субъединиц рекомбиназы, присутствующих в тетрамере синапса. Если 5'-гидроксильные группы атакуют 3'-фосфотирозиновую связь, одна пара цепей ДНК обменяет свои действия, образуя промежуточное соединение Холлидея . [3]

Приложения

Роль в бактериофаге P1

Рекомбиназа Cre играет важную роль в жизненном цикле бактериофага P1 . При инфицировании клетки система Cre-loxP используется для того, чтобы вызвать кольцевание ДНК P1. В дополнение к этому Cre также используется для разрешения димерной лизогенной ДНК P1, которая образуется во время деления клетки фага. [7]

Использование в исследованиях

Индуцируемая активация Cre достигается с помощью варианта CreER (рецептор эстрогена), который активируется только после доставки тамоксифена . [8] Это делается посредством слияния мутировавшего домена связывания лиганда рецептора эстрогена с рекомбиназой Cre, в результате чего Cre становится специфически активированным тамоксифеном. В отсутствие тамоксифена CreER приведет к перемещению мутировавшей рекомбиназы в цитоплазму. Белок останется в этом месте в своем неактивированном состоянии до тех пор, пока не будет дан тамоксифен. После введения тамоксифена он метаболизируется в 4-гидрокситамоксифен, который затем связывается с ER и приводит к транслокации CreER в ядро, где он затем может расщеплять сайты lox. [9] Важно отметить, что иногда флуоресцентные репортеры могут активироваться в отсутствие тамоксифена из-за утечки нескольких молекул рекомбиназы Cre в ядро, что в сочетании с очень чувствительными репортерами приводит к непреднамеренной маркировке клеток. [10] CreER(T2) был разработан для минимизации тамоксифен-независимой рекомбинации и максимизации чувствительности к тамоксифену.

Улучшения

В последние годы рекомбиназа Cre была улучшена путем преобразования в предпочтительные кодоны млекопитающих , удаления известных криптических сайтов сплайсинга , измененного стоп-кодона и снижения содержания CpG для снижения риска эпигенетического молчания у млекопитающих . [11] Также был выявлен ряд мутантов с повышенной точностью. [12]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Nagy A (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для настройки генома». Genesis . 26 (2): 99–109. doi : 10.1002/(SICI)1526-968X(200002)26:2<99::AID-GENE1>3.0.CO;2-B . PMID  10686599.
  2. ^ abcd Абремски К, Хёсс Р (февраль 1984). «Сайт-специфическая рекомбинация бактериофага P1. Очистка и свойства белка рекомбиназы Cre». Журнал биологической химии . 259 (3): 1509–1514. doi : 10.1016/S0021-9258(17)43437-5 . PMID  6319400.
  3. ^ abcd Van Duyne GD (2001). "Структурный взгляд на сайт-специфическую рекомбинацию cre-loxp". Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure . 30 : 87–104. doi :10.1146/annurev.biophys.30.1.87. PMID  11340053.
  4. ^ Ennifar E, Meyer JE, Buchholz F, Stewart AF, Suck D (сентябрь 2003 г.). «Кристаллическая структура дикого типа синапса Cre recombinase-loxP обнаруживает новую конформацию спейсера, предполагающую альтернативный механизм активации расщепления ДНК». Nucleic Acids Research . 31 (18): 5449–5460. doi :10.1093/nar/gkg732. PMC 203317 . PMID  12954782. 
  5. ^ ab Sternberg N, Hamilton D (август 1981). "Рекомбинация сайта бактериофага P1. I. Рекомбинация между сайтами loxP". Журнал молекулярной биологии . 150 (4): 467–486. doi :10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID  6276557.
  6. ^ ab Guo F, Gopaul DN, van Duyne GD (сентябрь 1997 г.). «Структура рекомбиназы Cre в комплексе с ДНК в синапсе сайт-специфической рекомбинации». Nature . 389 (6646): 40–46. Bibcode :1997Natur.389...40G. doi :10.1038/37925. PMID  9288963. S2CID  4401434.
  7. ^ Shaikh AC, Sadowski PD (февраль 1997 г.). «Рекомбиназа Cre расщепляет сайт lox в транс-положении». Журнал биологической химии . 272 ​​(9): 5695–5702. doi : 10.1074/jbc.272.9.5695 . PMID  9038180.
  8. ^ Walrath JC, Hawes JJ, Van Dyke T, Reilly KM (2010). «Генетически модифицированные мышиные модели в исследовании рака». Advances in Cancer Research . 106 : 113–64. doi :10.1016/S0065-230X(10)06004-5. ISBN 9780123747716. PMC  3533445 . PMID  20399958.
  9. ^ Kristianto J, Johnson MG, Zastrow RK, Radcliff AB, Blank RD (июнь 2017 г.). «Спонтанная рекомбиназная активность Cre-ERT2 in vivo». Transgenic Research . 26 (3): 411–417. doi :10.1007/s11248-017-0018-1. PMC 9474299. PMID 28409408.  S2CID 4377498  . 
  10. ^ Альварес-Аснар А, Мартинес-Коррал И, Даубель Н, Бетсгольц С, Мякинен Т, Генгель К (февраль 2020 г.). «Линии Т2». Трансгенные исследования . 29 (1): 53–68. дои : 10.1007/s11248-019-00177-8. ПМЦ 7000517 . ПМИД  31641921. 
  11. ^ Shimshek DR, Kim J, Hübner MR, Spergel DJ, Buchholz F, Casanova E, Stewart AF, Seeburg PH, Sprengel R (январь 2002 г.). «Экспрессия рекомбиназы Cre (iCre) с улучшением кодонов у мышей». Genesis . 32 (1): 19–26. doi :10.1002/gene.10023. PMID  11835670. S2CID  46000513.
  12. ^ Ерошенко Н., Чёрч ГМ (сентябрь 2013 г.). «Мутанты рекомбиназы Cre с улучшенной точностью». Nature Communications . 4 : 2509. Bibcode : 2013NatCo ... 4.2509E. doi : 10.1038/ncomms3509. PMC 3972015. PMID  24056590. 

Внешние ссылки