Саузерн-блоттинг — это метод, используемый для обнаружения и количественного определения определенной последовательности ДНК в образцах ДНК. Этот метод используется в молекулярной биологии . Вкратце, очищенная ДНК из биологического образца (например, крови или ткани) переваривается ферментами рестрикции , а полученные фрагменты ДНК разделяются с помощью электрического тока, который перемещает их через ситообразный гель или матрицу, что позволяет более мелким фрагментам двигаться быстрее, чем более крупные фрагменты. Фрагменты ДНК переносятся из геля или матрицы на твердую мембрану, которая затем подвергается воздействию зонда ДНК, помеченного радиоактивной, флуоресцентной или химической меткой. Метка позволяет визуализировать любые фрагменты ДНК, содержащие последовательности, комплементарные последовательности ДНК-зонда, в рамках Саузерн-блоттинга. [1]
Саузерн-блоттинг сочетает в себе перенос фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом , на мембрану фильтра в процессе, называемом блоттингом , и последующее обнаружение фрагментов путем гибридизации зонда . [2]
Метод назван в честь британского биолога Эдвина Сазерна , который впервые опубликовал его в 1975 году. [3] Другие методы блоттинга (например, вестерн-блоттинг , [4] нозерн-блоттинг , восточный блоттинг , юго-западный блоттинг ), в которых используются аналогичные принципы, но с использованием РНК. или белок, позже были названы в честь направлений компаса как своего рода игра слов от имени Саузерна. Поскольку название одноименное , слово Southern пишется с заглавной буквы, как это принято в именах собственных . По аналогии этому соглашению могут следовать и названия других методов блоттинга. [5]
История
Саузерн изобрел Саузерн-блот после объединения трех инноваций, первая из которых - это эндонуклеазы рестрикции, которые были разработаны в Университете Джонса Хопкинса Томом Келли и Гамильтоном Смитом . Эти эндонуклеазы рестрикции используются для разрезания ДНК по определенной последовательности. Кеннет и Норин Мюррей представили эту технику как южную. Второе нововведение — гель-электрофорез, основанный на разделении смесей ДНК, РНК или белков в зависимости от размера молекул, который также был разработан в Университете Джонса Хопкинса Дэниелом Натансом и Кэтлин Данна в 1971 году. Третье нововведение — методы блоттинга. который был разработан Фредериком Сэнгером , когда он переносил молекулы РНК на бумагу DEAE. Саузерн-блоттинг был изобретен в 1973 году, но не был опубликован до 1975 года. Хотя он был опубликован позже, метод получил распространение, когда Саузерн представил метод Саузерн-блоттинга ученому из лаборатории Колд-Спринг-Харбор по имени Майкл Мэтьюз, нарисовав этот метод на бумаге. [6]
Метод
Геномную ДНК расщепляют одним или несколькими ферментами рестрикции, затем фрагменты ДНК фракционируют по размеру с помощью гель-электрофореза. Прежде чем фрагменты ДНК будут перенесены на твердую мембрану, которая представляет собой нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану, ее сначала денатурируют щелочной обработкой. [7] После иммобилизации фрагментов ДНК на мембране используются методы прегибридизации для уменьшения неспецифического связывания зондов, затем фрагменты на мембране гибридизуются либо с радиоактивно мечеными, либо с нерадиоактивно меченными ДНК, РНК или олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны последовательность целевой ДНК, то для визуализации целевой ДНК используются методы обнаружения. [8]
Выделение ДНК. Исследуемая ДНК выделяется из различных тканей. Наиболее подходящим источником ДНК является ткань крови. Однако его можно выделить из разных тканей (волос, спермы, слюны и т. д.).
Расщепление ДНК: рестрикционные эндонуклеазы используются для разрезания нитей ДНК с высокой молекулярной массой на более мелкие фрагменты. Это делается путем добавления желаемого количества ДНК, которое можно изменить в зависимости от используемого зонда и сложности ДНК, с ферментом рестрикции, ферментным буфером и очищенной водой, а затем инкубируют реакцию при 37 ° C в течение ночи.
Гель-электрофорез: фрагменты ДНК затем подвергаются электрофорезу в агарозном геле , чтобы разделить их по размеру. Если некоторые фрагменты ДНК имеют размер более 15 т.п.н. , то перед блоттингом гель можно обработать кислотой, например разбавленной HCl . Это депуринирует фрагменты ДНК, разбивая ДНК на более мелкие части, тем самым обеспечивая более эффективный перенос из геля на мембрану.
Денатурация: если используются щелочные методы переноса, гель ДНК помещают в щелочной раствор (обычно содержащий гидроксид натрия ) для денатурации двухцепочечной ДНК. Денатурация в щелочной среде может улучшить связывание отрицательно заряженных тиминовых остатков ДНК с положительно заряженными аминогруппами мембраны, разделяя ее на отдельные цепи ДНК для последующей гибридизации с зондом (см. ниже), и разрушая любую остаточную РНК, которая может все еще присутствуют в ДНК. Однако выбор щелочного метода переноса вместо нейтрального часто является эмпирическим и может привести к эквивалентным результатам. [ нужна цитата ]
Блоттинг: лист нитроцеллюлозной (или, альтернативно, нейлоновой ) мембраны помещается поверх (или под, в зависимости от направления переноса) геля. К гелю постоянно прикладывают давление (либо с помощью всасывания, либо путем размещения стопки бумажных полотенец и груза поверх мембраны и геля), чтобы обеспечить хороший и равномерный контакт между гелем и мембраной. При переносе путем отсасывания используется 20X буфер SSC для обеспечения герметичности и предотвращения высыхания геля. Затем используется перенос буфера под действием капиллярности из области с высоким водным потенциалом в область с низким водным потенциалом (обычно фильтровальная бумага и бумажные салфетки) для перемещения ДНК из геля на мембрану; ионообменные взаимодействия связывают ДНК с мембраной за счет отрицательного заряда ДНК и положительного заряда мембраны. Для переноса фрагментов ДНК на твердую мембрану можно использовать пять методов: [8] 1. Капиллярный перенос вверх: этот метод переносит фрагмент ДНК вверх из геля на мембрану, где будет происходить поток жидкости или буфера. вверх, 2. Капиллярный перенос вниз: этот метод осуществляется путем помещения геля на поверхность мембраны (обычно нейлоновой заряженной мембраны), и фрагменты ДНК будут переноситься в нисходящем направлении с потоком щелочного буфера. 3. Одновременно. перенос на две мембраны: этот метод используется для одновременного переноса фрагментов ДНК высокой концентрации из геля на две мембраны. 4. Электрофоретический перенос: в этом методе обычно используется сильный электрический ток, что затрудняет эффективный перенос ДНК из-за температуры используемый буфер, поэтому эти машины могут быть либо оснащены охлаждающими машинами, либо использоваться в холодной зоне. 5. Вакуумный перенос: в этом методе используется буфер из верхней камеры для переноса ДНК из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану, гель помещают непосредственно на мембрану, а мембрану помещают на пористый экран в вакуумной камере.
Иммобилизация: затем мембрану запекают в вакууме или обычной печи при температуре 80 °C в течение 2 часов (стандартные условия: нитроцеллюлозная или нейлоновая мембрана) или подвергают воздействию ультрафиолетового излучения (нейлоновая мембрана) для постоянного прикрепления перенесенной ДНК к мембране.
Гибридизация: после этого зонд гибридизации — одиночный фрагмент ДНК с определенной последовательностью, присутствие которой в целевой ДНК должно быть установлено, — подвергается воздействию мембраны. ДНК-зонд помечается так, чтобы ее можно было обнаружить, обычно путем включения радиоактивности или маркировки молекулы флуоресцентным или хромогенным красителем . В некоторых случаях гибридизационный зонд может быть изготовлен из РНК, а не из ДНК. Чтобы гарантировать специфичность связывания зонда с ДНК образца, в наиболее распространенных методах гибридизации используют ДНК спермы лосося или сельди для блокирования поверхности мембраны и целевой ДНК, деионизированный формамид и детергенты, такие как SDS, для уменьшения неспецифического связывания зонд.
Обнаружение: После гибридизации избыток зонда смывается с мембраны (обычно с использованием SSC-буфера ), и картина гибридизации визуализируется на рентгеновской пленке методом авторадиографии в случае радиоактивного или флуоресцентного зонда или по развитию окраски на мембрану, если используется хромогенный метод обнаружения.
Интерпретация результатов
Гибридизация зонда со специфическим фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, комплементарную зонду. Стадия переноса ДНК из геля электрофореза на мембрану позволяет легко связывать меченый зонд гибридизации с фракционированной по размеру ДНК. Это также позволяет фиксировать гибриды мишень-зонд, необходимые для анализа авторадиографией или другими методами обнаружения. Саузерн-блоттинг, выполненный с геномной ДНК, расщепленной рестрикционным ферментом, можно использовать для определения количества последовательностей (например, копий гена) в геноме . Зонд, который гибридизуется только с одним сегментом ДНК, который не был разрезан рестриктазой, будет давать одну полосу при Саузерн-блоттинге, тогда как, вероятно, будут наблюдаться множественные полосы, когда зонд гибридизуется с несколькими очень похожими последовательностями (например, с теми, которые может быть результатом дублирования последовательности). Чтобы улучшить специфичность и снизить гибридизацию зонда с последовательностями, идентичными менее чем на 100%, параметры гибридизации можно изменить (например, повысив температуру гибридизации или понизив содержание соли). Нейлоновая мембрана более прочна и обладает более высокой способностью связывания фрагментов ДНК, чем нитроцеллюлозная мембрана, поэтому фрагменты ДНК будут лучше фиксироваться на мембране, даже если мембрана инкубируется при высоких температурах. Кроме того, по сравнению с нитроцеллюлозной мембраной, которая требует буфера с высокой ионной силой для связывания фрагментов ДНК с мембраной, в нейлоновых заряженных мембранах используются буферы с очень низкой ионной силой для переноса на мембрану даже небольших фрагментов ДНК размером около 50 пар оснований, обычно ДНК, подлежащую переносу, отделяется полиакриламидным гелем. На этапе блоттинга наиболее эффективным методом переноса ДНК из геля на мембрану является вакуумный перенос, поскольку он переносит ДНК более быстро и количественно. [8]
Приложения
Саузерн-блоттинг-перенос можно использовать для клонирования на основе гомологии на основе аминокислотной последовательности белкового продукта целевого гена. Олигонуклеотиды сконструированы так, что они комплементарны целевой последовательности. Олигонуклеотиды химически синтезируются, маркируются радиоактивным изотопом и используются для скрининга библиотеки ДНК или других коллекций клонированных фрагментов ДНК. Последовательности, которые гибридизуются с зондом гибридизации, дополнительно анализируются, например, для получения полноразмерной последовательности целевого гена.
С помощью этого метода можно изучить нормальную хромосомную или генную перестройку. [7]
Может использоваться для поиска подобных последовательностей у других видов или в геноме за счет снижения специфичности гибридизации. [7]
В смеси, имеющей разные размеры переваренной ДНК, его используют для идентификации рестрикционного фрагмента определенного размера. [7]
Это полезно для выявления изменений, происходящих в генах, включая вставки, перестановки, делеции и точечные мутации , которые влияют на сайты рестрикции. [7]
Более того, он используется для идентификации конкретной области, которая использует множество различных ферментов рестрикции при картировании рестрикции. Также его используют для определения того, какой сайт узнавания был изменен из-за полиморфизма одного нуклеотида , который изменяет конкретный фермент рестрикции. [7]
Саузерн-блоттинг также можно использовать для идентификации метилированных участков в определенных генах. Особенно полезны нуклеазы рестрикции MspI и HpaII , обе из которых распознают и расщепляют одну и ту же последовательность. Однако HpaII требует, чтобы C в этом сайте был метилирован, тогда как MspI расщепляет только неметилированную в этом сайте ДНК. Следовательно, любые метилированные сайты в последовательности, анализируемой с помощью конкретного зонда, будут расщепляться первым, но не вторым ферментом. [9]
Может использоваться для идентификации личности посредством снятия отпечатков пальцев и для диагностики заболеваний. [10]
Ограничения
По сравнению с другими тестами Саузерн-блоттинг представляет собой сложную методику, состоящую из нескольких этапов, и эти этапы требуют дорогостоящего оборудования и реагентов. [10]
Необходимо высокое качество и большое количество ДНК. [10]
Саузерн-блоттинг — трудоемкий метод, с помощью которого можно оценить только размер ДНК, поскольку это полуколичественный метод. [10]
Его нельзя использовать для обнаружения мутаций на уровне пары оснований. [10]
^ «Говорящий глоссарий генетических терминов | NHGRI» . www.genome.gov . Национальные институты здоровья . Проверено 24 января 2023 г. В данную статью включен текст из этого источника, находящегося в свободном доступе .
^ "Южное пятно".
↑ Южный, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Обнаружение специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных с помощью гель-электрофореза». Журнал молекулярной биологии . 98 (3): 503–517. дои : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. S2CID 20126741.
^ Таубин; Штелин, Т; Гордон, Дж; и другие. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: процедура и некоторые применения». ПНАС . 76 (9): 4350–4. Бибкод : 1979PNAS...76.4350T. дои : 10.1073/pnas.76.9.4350 . ПМК 411572 . ПМИД 388439.
^ Бернетт, В. Нил (апрель 1981 г.). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфата натрия и полиакриламида в немодифицированную нитроцеллюлозу и рентгенографическое обнаружение с помощью антител и радиойодированного белка А». Аналитическая биохимия . 112 (2): 195–203. дои : 10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. ПМИД 6266278.
^ Тофано, Дайдри; Вичерс, Ильза Р.; Кук-Диган, Роберт (15 августа 2006 г.). «Эдвин Саузерн, блоттинг ДНК и технология микрочипов: тематическое исследование меняющейся роли патентов в академической молекулярной биологии». Геномика, общество и политика . 2 (2). дои : 10.1186/1746-5354-2-2-50 . ISSN 1746-5354. ПМК 5424904 .
^ abcdef Гленн, Гэри; Андреу, Лефкотеа-Василики (01 января 2013 г.), «Глава пятая - Анализ ДНК методом Саузерн-блоттинга», в Лорш, Джон (редактор), ДНК, том. 529, Academic Press, стр. 47–63, номер документа : 10.1016/b978-0-12-418687-3.00005-7, ISBN.9780124186873, PMID 24011036 , получено 4 января 2023 г.
^ abc Грин, Майкл Р.; Сэмбрук, Джозеф (июль 2021 г.). «Анализ ДНК методом Саузерн-блоттинга». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2021 (7): pdb.top100396. дои : 10.1101/pdb.top100396 . ISSN 1940-3402. PMID 34210774. S2CID 235710916.
^ Биохимия, 3-е издание, Мэтьюз, Ван Холд и др., Addison Wesley Publishing, стр. 977.
^ abcde Сапкота, Анупама (3 июня 2021 г.). «Южный блоттинг - определение, принцип, этапы, результаты, применение». Микробные заметки . Проверено 4 января 2023 г.
.jpg/1280px-Recombinant_DNA-_southern_blot_(1).jpg)
В данную статью включен текст из этого источника, находящегося в свободном доступе .