Сине -белый экран — это метод скрининга , который позволяет быстро и удобно обнаруживать рекомбинантные бактерии в экспериментах по молекулярному клонированию на основе векторов . Этот метод скрининга обычно выполняется с использованием подходящего штамма бактерий , но могут использоваться и другие организмы, такие как дрожжи. ДНК трансформации лигируется в вектор . Затем вектор вставляется в компетентную клетку-хозяина, пригодную для трансформации, которую затем выращивают в присутствии X-gal . Клетки, трансформированные векторами, содержащими рекомбинантную ДНК , будут производить белые колонии; клетки, трансформированные нерекомбинантными плазмидами (т. е. только вектором), вырастают в синие колонии.
Молекулярное клонирование является одной из наиболее часто используемых процедур в молекулярной биологии . Интересующий ген может быть вставлен в плазмидный вектор посредством лигирования , а затем плазмида трансформируется в клетки Escherichia coli . Однако не все плазмиды, трансформированные в клетки, могут содержать желаемую генную вставку, и проверка каждой отдельной колонии на наличие вставки занимает много времени. Поэтому метод обнаружения вставки был бы полезен для того, чтобы сделать эту процедуру менее трудоемкой и требующей меньше времени. Одним из ранних методов, разработанных для обнаружения вставки, является сине-белый скрининг, который позволяет идентифицировать успешные продукты реакций клонирования по цвету бактериальной колонии .
Метод основан на принципе α-комплементации гена β-галактозидазы . Это явление α-комплементации было впервые продемонстрировано в работе, проделанной Агнес Ульман в лаборатории Франсуа Жакоба и Жака Моно , где было показано, что функция неактивной мутантной β-галактозидазы с удаленной последовательностью была спасена фрагментом β-галактозидазы, в котором та же самая последовательность, α-донорный пептид, все еще остается нетронутой. [1] Лэнгли и др. показали, что мутантная нефункциональная β-галактозидаза была лишена части своего N-конца с удаленными остатками 11—41, но она может быть дополнена пептидом, образованным остатками 3—90 β-галактозидазы. [2] Позднее Мессинг и др. сконструировали нитевидный фаг M13 , содержащий последовательность, кодирующую первые 145 аминокислот , а α-комплементация с использованием вектора была продемонстрирована путем образования синих бляшек, когда клетки, содержащие неактивный белок, были инфицированы фагом, а затем выращены на чашках Петри, содержащих X-gal. [3]
Серия векторов клонирования плазмид pUC Виейры и Мессинга была разработана на основе системы M13 и стала первой плазмидой, сконструированной для использования этого метода скрининга. [4] В этом методе ДНК, лигированная в плазмиду, нарушает α-пептид и, следовательно, процесс комплементации, и функциональная β-галактозидаза не может образоваться. Клетки, трансформированные плазмидой, содержащей вставку, поэтому образуют белые колонии, в то время как клетки, трансформированные плазмидой без вставки, образуют синие колонии; результат успешной лигации можно легко определить по белой окраске клеток, образовавшихся из неудачных синих. [5]
β-галактозидаза — это белок, кодируемый геном lacZ оперона lac , и в активном состоянии он существует в виде гомотетрамера . Однако у мутантной β-галактозидазы, полученной из штамма E. coli M15 , удалены N-концевые остатки 11—41, и этот мутант, ω-пептид, не способен образовывать тетрамер и неактивен. Однако эта мутантная форма белка может полностью вернуться в свое активное тетрамерное состояние в присутствии N-концевого фрагмента белка, α-пептида. Спасение функции мутантной β-галактозидазы α-пептидом называется α-комплементацией.
В этом методе скрининга штамм хозяина E. coli несет мутант с делецией lacZ ( lacZΔM15 ), который содержит ω-пептид, в то время как используемые плазмиды несут последовательность lacZα , которая кодирует первые 59 остатков β-галактозидазы, α-пептид. Ни один из них не функционален сам по себе. Однако, когда два пептида экспрессируются вместе, как когда плазмида, содержащая последовательность lacZα, трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональный фермент β-галактозидазу .
Метод скрининга сине-белого цвета работает, нарушая этот процесс α-комплементации. Плазмида несет в последовательности lacZα внутренний сайт множественного клонирования (MCS). Этот MCS в последовательности lacZα может быть разрезан рестриктазами, так что чужеродная ДНК может быть вставлена в ген lacZ α, тем самым нарушая ген, который производит α-пептид. Следовательно, в клетках, содержащих плазмиду со вставкой, не может быть образована функциональная β-галактозидаза .
Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить с помощью X-gal , бесцветного аналога лактозы, который может расщепляться β-галактозидазой с образованием 5-бром-4-хлор-индоксила, который затем спонтанно димеризуется и окисляется с образованием ярко-синего нерастворимого пигмента 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго. Это приводит к характерному синему цвету в клетках, содержащих функциональную β-галактозидазу. Синие колонии, таким образом, показывают, что они могут содержать вектор с непрерывным lacZα (следовательно, без вставки), в то время как белые колонии, где X-gal не гидролизуется, указывают на наличие вставки в lacZα , которая нарушает образование активной β-галактозидазы.
Рекомбинантные клоны можно далее анализировать, выделяя и очищая небольшие количества плазмидной ДНК из трансформированных колоний, а для разрезания клона и определения наличия в нем интересующего фрагмента можно использовать ферменты рестрикции. [6] Если необходимо секвенировать ДНК, плазмиды из колоний необходимо будет выделить в определенной точке, либо разрезать с помощью ферментов рестрикции, либо выполнить другие анализы.
Правильный тип вектора и компетентных клеток являются важными факторами при планировании сине-белого экрана. Плазмида должна содержать lacZ α, и примерами таких плазмид являются pUC19 и pBluescript. Клетка E. coli должна содержать мутантный ген lacZ с удаленной последовательностью (т. е. lacZΔM15 ), и некоторые из обычно используемых клеток с таким генотипом — JM109, DH5α и XL1-Blue. Следует также понимать, что на оперон lac влияет присутствие глюкозы. Белок EIIA Glc , который участвует в импорте глюкозы, отключает пермеазу лактозы, когда глюкоза транспортируется в клетку. Поэтому среда, используемая в агаровой пластине, не должна содержать глюкозу.
X-gal чувствителен к свету, поэтому его раствор и чашки, содержащие X-gal, следует хранить в темноте. Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), который действует как индуктор lac оперона , может быть использован в среде для усиления экспрессии LacZ.
X-gal — дорогой материал, поэтому были разработаны другие методы для скрининга бактерий. GFP был разработан в качестве альтернативы для скрининга бактерий. Концепция похожа на α-комплементацию, при которой вставка ДНК может нарушить кодирующую последовательность в векторе и, таким образом, нарушить выработку GFP, что приведет к нефлуоресцирующим бактериям. [7] Бактерии, имеющие рекомбинантные векторы (вектор + вставка), будут белыми и не будут экспрессировать белок GFP, в то время как нерекомбинантные (вектор) будут и будут флуоресцировать под УФ-светом. GFP в целом использовался в качестве репортерного гена, с помощью которого люди могут окончательно определить, несет ли клон ген, который анализируют исследователи. Иногда среда, в которой растут колонии, может влиять на скрининг и вносить ложноположительные результаты. [8] X-gal на среде может иногда деградировать, давая синий цвет, или GFP может потерять свою флуоресценцию из-за среды и может повлиять на возможности исследователей определять колонии с желаемым рекомбинантом и те, которые им не обладают. [9]
Некоторые белые колонии могут не содержать желаемую рекомбинантную плазмиду по ряду причин. Лигированная ДНК может быть неправильной или неправильно лигированной, и возможно, что некоторый линеаризованный вектор был трансформирован, его концы «отремонтированы» и лигированы вместе, так что LacZα не образуется, и синие колонии не могут быть сформированы. Мутация также может привести к тому, что α-фрагмент не будет экспрессироваться. Колония без вектора вообще будет также выглядеть белой и иногда может появляться как сателлитные колонии после того, как используемый антибиотик будет исчерпан. Также возможно, что синие колонии могут содержать вставку. Это происходит, когда вставка находится «в рамке» с геном LacZα, а STOP-кодон отсутствует во вставке. Это может привести к экспрессии слитого белка, который имеет функциональный LacZα, если его структура не нарушена. Правильная рекомбинантная конструкция иногда может давать более светлые синие колонии, что может усложнить ее идентификацию.
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )