β-галактозидаза (EC 3.2.1.23, лактаза , бета-гал или β-гал ; систематическое название β- D -галактозидгалактогидролаза ) представляет собой фермент гликозидгидролазу , который катализирует гидролиз концевых невосстанавливающих остатков β- D -галактозы в β- D -галактозиды.
β-галактозиды включают углеводы, содержащие галактозу , где гликозидная связь находится над молекулой галактозы. Субстратами различных β-галактозидаз являются ганглиозид GM1, лактозилцерамиды, лактоза и различные гликопротеины . [1]
β-галактозидаза представляет собой экзогликозидазу , которая гидролизует β- гликозидную связь , образующуюся между галактозой и ее органической частью. Он также может расщеплять фукозиды и арабинозиды , но с гораздо меньшей эффективностью. Это важный фермент в организме человека. Дефицит белка может привести к галактосиалидозу или синдрому Моркио B. В E. coli ген lacZ является структурным геном β-галактозидазы; который присутствует как часть lac -оперона индуцибельной системы , который активируется в присутствии лактозы при низком уровне глюкозы . Синтез β-галактозидазы прекращается, когда уровень глюкозы становится достаточным. [2]
β-галактозидаза имеет множество гомологов , основанных на схожих последовательностях. Некоторые из них выделяют β-галактозидазу (EBG), β-глюкозидазу , 6-фосфо-β-галактозидазу, β-маннозидазу и лактазо-флоризингидролазу. Хотя они могут быть структурно похожими, все они имеют разные функции. [3] Бета-гал ингибируется L -рибозой и конкурентными ингибиторами 2-фенилэтил-1-тио-β- D -галактопиранозидом (PETG), D- галактонолактоном, изопропилтио-β- D- галактозидом (IPTG) и галактозой. . [4]
β-галактозидаза важна для организмов, поскольку она является ключевым поставщиком энергии и источником углерода за счет расщепления лактозы до галактозы и глюкозы. Это также важно для сообщества людей с непереносимостью лактозы, поскольку оно отвечает за производство безлактозного молока и других молочных продуктов. У многих взрослых людей отсутствует фермент лактаза , который выполняет ту же функцию, что и β-галактозидаза, поэтому они не могут правильно переваривать молочные продукты. β-галактоза используется в таких молочных продуктах, как йогурт, сметана и некоторые сыры, которые обрабатываются ферментом для расщепления лактозы перед употреблением в пищу человеком. В последние годы β-галактозидаза исследовалась как потенциальное средство лечения непереносимости лактозы посредством заместительной генной терапии, при которой ее можно было бы поместить в ДНК человека, чтобы люди могли расщеплять лактозу самостоятельно. [5] [6]
1023 аминокислоты β-галактозидазы E. coli были секвенированы в 1983 году [7] , а ее структура определена одиннадцать лет спустя, в 1994 году. Белок представляет собой гомотетрамер массой 464 кДа с 2,2,2-точечной симметрией . [8] Каждая единица β-галактозидазы состоит из пяти доменов ; домен 1 представляет собой β-цилиндр типа желеобразного рулона , домен 2 и 4 представляет собой цилиндр типа фибронектина III , домен 5 представляет собой новый β-сэндвич, а центральный домен 3 представляет собой искаженный цилиндр типа TIM , лишенный пятой спирали с искажение в шестой нити. [8]
Третий домен содержит активный сайт. [9] Активный центр состоит из элементов двух субъединиц тетрамера, а диссоциация тетрамера на димеры удаляет критические элементы активного сайта. Аминоконцевая последовательность β-галактозидазы, α-пептида, участвующего в α-комплементации, участвует в интерфейсе субъединиц. Его остатки 22–31 помогают стабилизировать четырехспиральный пучок, который образует основную часть этого интерфейса, а остатки 13 и 15 также вносят вклад в активирующий интерфейс. [ нужна цитация ] Эти структурные особенности служат объяснением явления α-комплементации, при котором удаление аминоконцевого сегмента приводит к образованию неактивного димера.
β-галактозидаза может катализировать три различные реакции в организмах. В одном из них он может пройти процесс, называемый трансгалактозилированием, с образованием аллолактозы , создавая петлю положительной обратной связи для производства β-галактозы. Аллолактоза также может расщепляться с образованием моносахаридов. Он также может гидролизовать лактозу до галактозы и глюкозы , которые переходят в гликолиз . [3] Активный центр β-галактозидазы катализирует гидролиз ее дисахаридного субстрата посредством «мелкого» (непродуктивный сайт) и «глубокого» (продуктивный сайт) связывания. Галактозиды , такие как PETG и IPTG, будут связываться в поверхностном участке, когда фермент находится в «открытой» конформации, тогда как аналоги переходного состояния , такие как L -рибоза и D -галактонолактон, будут связываться в глубоком участке, когда конформация «закрыта». [4]
Ферментативная реакция состоит из двух химических стадий: галактозилирования и дегалактозилирования. Галактозилирование — это первая химическая стадия реакции, в которой Glu461 отдает протон гликозидному кислороду, в результате чего галактоза ковалентно связывается с Glu537. На втором этапе, дегалактозилировании, ковалентная связь разрывается, когда Glu461 принимает протон, заменяя галактозу водой. Во время реакции в глубоком участке фермента возникают два переходных состояния , один раз после каждой стадии. При участии воды в реакции образуется галактоза, в противном случае, когда акцептором на втором этапе выступает D -глюкоза, происходит трансгалактозилирование. [4] Кинетически измерено, что отдельные тетрамеры белка катализируют реакции со скоростью 38 500 ± 900 реакций в минуту. [10] Одновалентные ионы калия (K + ), а также двухвалентные ионы магния (Mg 2+ ) необходимы для оптимальной активности фермента. β-связь субстрата расщепляется концевой карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты .
Считалось, что в E. coli Glu-461 является нуклеофилом в реакции замещения . [11] Однако теперь известно, что Glu-461 является кислотным катализатором. Вместо этого Glu-537 является настоящим нуклеофилом, [12] связывающимся с галактозильным промежуточным соединением. У человека нуклеофилом реакции гидролиза является Glu -268. [13] Gly794 важен для активности β-галактозидазы. Он отвечает за перевод фермента в «закрытую», связанную с лигандом конформацию или «открытую» конформацию, действуя как «шарнир» для петли активного центра. Различные конформации гарантируют, что в активном сайте происходит только предпочтительное связывание. В присутствии медленного субстрата активность Gly794 возрастала, а также увеличивалось галактозилирование и снижалось дегалактозилирование. [4]
Анализ β-галактозидазы часто используется в генетике , молекулярной биологии и других науках о жизни . [14] Активный фермент можно обнаружить с помощью искусственного хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β- D -галактопиранозида, X-гал . β-галактозидаза расщепляет гликозидную связь в X-гал и образует галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол, которые димеризуются и окисляются до 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго, интенсивно синий продукт, который легко идентифицировать и количественно оценить. [15] Используется, например, в сине-белом экране . [16] Его продукция может быть индуцирована негидролизуемым аналогом аллолактозы , IPTG , который связывает и высвобождает lac-репрессор из lac-оператора, тем самым позволяя продолжить инициацию транскрипции.
Он обычно используется в молекулярной биологии в качестве репортерного маркера для мониторинга экспрессии генов. Он также демонстрирует явление, называемое α-комплементацией, которое лежит в основе сине-белого скрининга рекомбинантных клонов. Этот фермент можно разделить на два пептида, LacZα и LacZΩ , ни один из которых не активен сам по себе, но когда оба присутствуют вместе, они спонтанно собираются в функциональный фермент. Это свойство используется во многих векторах клонирования , где присутствие гена lacZα в плазмиде может комплементировать в транс другой мутантный ген, кодирующий LacZΩ в конкретных лабораторных штаммах E. coli . Однако когда фрагменты ДНК встраиваются в вектор, продукция LacZα нарушается, поэтому клетки не проявляют активности β-галактозидазы. Присутствие или отсутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить с помощью X-gal , который при расщеплении β-галактозидазой дает характерный синий краситель, тем самым обеспечивая простой способ различения присутствия или отсутствия клонированного продукта в плазмиде. В исследованиях хромосомных транслокаций при лейкозе Добсон и его коллеги использовали слитый белок LacZ у мышей [17] , используя склонность β-галактозидазы к олигомеризации, чтобы предположить потенциальную роль олигомерности в функции слитого белка MLL. [18]
Недавнее исследование, проведенное в 2020–2021 годах, показало, что активность бета-галактозидазы коррелирует со старением клеток. Старение клеток можно интерпретировать как клетки, которые не делятся, но не умирают. Активность бета-галактозидазы может быть сверхвыраженной, что может привести к различным заболеваниям, поражающим широкий спектр систем организма. К этим системам относятся сердечно-сосудистая система, скелетная система и многие другие. Обнаружение стареющих клеток может быть достигнуто путем измерения активности лизосомальной бета-галактозидазы. [19]
Новая изоформа бета-галактозидазы с оптимальной активностью при pH 6,0 (связанная со старением бета-гал или SA-бета-гал ) [20] , которая специфически выражается в старении (необратимой остановке роста клеток). Для его обнаружения даже были разработаны специальные количественные анализы. [21] [15] [22] Однако теперь известно, что это происходит из-за сверхэкспрессии и накопления лизосомальной эндогенной бета-галактозидазы, [23] и ее экспрессия не требуется для старения. Тем не менее, он остается наиболее широко используемым биомаркером стареющих и стареющих клеток, поскольку он надежен и легко обнаруживается.
Некоторые виды бактерий, включая E. coli , имеют дополнительные гены β-галактозидазы. Второй ген, названный геном развитой β-галактозидазы ( ebgA ), был обнаружен, когда штаммы с удаленным геном lacZ (но все еще содержащими ген галактозидпермеазы, lacY ) были высеяны на среду, содержащую лактозу (или другие 3-галактозиды) в качестве единственного вещества. источник углерода. Через некоторое время некоторые колонии начали расти. Однако белок EbgA является неэффективной лактазой и не позволяет расти на лактозе. Два класса одноточечных мутаций резко улучшают активность фермента ebg по отношению к лактозе. [24] [25] и, как следствие, мутантный фермент способен заменить lacZ β-галактозидазу. [26] EbgA и LacZ идентичны на 50% на уровне ДНК и на 33% на уровне аминокислот. [27] Активный фермент ebg представляет собой совокупность продуктов гена ebgA и гена ebgC в соотношении 1:1, причем активная форма ферментов ebg представляет собой гетерооктамер α 4 β4. [28]
Большая часть работ, проделанных в области β-галактозидазы, получена из E. coli. Однако фермент можно найти во многих растениях (особенно во фруктах), млекопитающих, дрожжах, бактериях и грибах. [29] Гены β-галактозидазы могут различаться по длине кодирующей последовательности и длине белков, образованных аминокислотами. [30] Это разделяет β-галактозидазы на четыре семейства: GHF-1, GHF-2, GHF-35 и GHF-42. [31] E. Coli принадлежит к GHF-2, все растения принадлежат к GHF-35, и Thermus thermophilus принадлежит к GHF-42. [31] [30] Различные фрукты могут экспрессировать несколько генов β-галактозидазы. Существует по крайней мере семь генов β-галактозидазы, экспрессируемых в развитии плодов томата, аминокислотное сходство которых составляет от 33% до 79%. [32] Исследование, направленное на выявление размягчения плодов персиков, выявило 17 различных экспрессий генов β-галактозидаз. [30] Единственная другая известная кристаллическая структура β-галактозидазы принадлежит Thermus thermophilus . [31]