Первый раунд Кубка УЕФА 2008–09 начался 16 сентября 2008 года, в ходе которого число участников сократилось до 40 команд в рамках подготовки к групповому этапу.
32 команды вошли в турнир в первом раунде, вместе с 32 победителями предыдущего раунда и 16 проигравшими из третьего квалификационного раунда Лиги чемпионов . Затем 80 команд были разделены на восемь групп по десять команд; пять сеяных команд и пять несеяных команд. Жеребьевка была основана на их рейтинге коэффициентов с одним исключением: ни одна страна не может иметь несколько команд в одной группе. Команды, занимающие 108-е место или выше, были сеяными, как и не имеющие рейтинга команды из Англии и Испании. Жеребьевка, которую проводил генеральный секретарь УЕФА Дэвид Тейлор , состоялась 29 августа 2008 года в 13:00 по центральноевропейскому времени в Монако.
Матчи состоялись 18 сентября и 2 октября 2008 года.
Девять из 40 матчей выиграла несеяная команда. Девять сеяных проигравших команд, с указанием их рейтинга, были: Эвертон (50), Рапид Бухарест (58), Бешикташ (60), Спарта Прага (68), Динамо Бухарест (69), Левски София (80), Аустрия Вена (82), Ренн (97) и Хапоэль Тель-Авив (108).
«Герта» выиграла со счетом 2:0 по сумме двух матчей.
«Шальке 04» выиграл со счетом 5:2 по сумме двух матчей.
«Олимпиакос» выиграл со счетом 7:0 по сумме двух матчей.
ЦСКА Москва выиграл со счетом 3:1 по сумме двух матчей.
«Русенборг» выиграл со счетом 5–3 по сумме двух матчей.
«Штутгарт» выиграл со счетом 4–3 по сумме двух матчей.
Ренн 2–2 Твенте по сумме двух матчей. Твенте выиграл по правилу выездного гола.
«Аякс» выиграл со счетом 6:1 по сумме двух матчей.
«Тоттенхэм Хотспур» выиграл со счетом 3:2 по сумме двух матчей.
«Копенгаген» выиграл со счетом 3:2 по сумме двух матчей.
МШК Жилина выиграла со счетом 2:1 по сумме двух матчей.
«Боруссия Дортмунд» 2–2 «Удинезе» по сумме двух матчей. «Удинезе» выиграл со счетом 4–3 по пенальти.
«Брага» выиграла со счетом 6:0 по сумме двух матчей.
«Фейеноорд» 2–2 «Кальмар» по сумме двух матчей. «Фейеноорд» выиграл по правилу выездного гола.
«Гамбург» выиграл со счетом 2:0 по сумме двух матчей.
Сент-Этьен выиграл по сумме двух матчей со счетом 4–2.
«Милан» выиграл со счетом 4–1 по сумме двух матчей.
«Партизан» выиграл со счетом 3:1 по сумме двух матчей.
«Астон Вилла» выиграла со счетом 4–2 по сумме двух матчей.
Лех Познань выиграл по сумме двух матчей со счетом 5–4.
Херенвен выиграл по сумме двух матчей со счетом 6–3.
Бранн – «Депортиво Ла-Корунья» 2–2 по сумме двух матчей. «Депортиво Ла-Корунья» выиграла по пенальти со счетом 3–2.
Славия Прага 1–1 Васлуй по сумме двух матчей. Славия Прага выиграла по правилу выездного гола.
Московский «Спартак» выиграл со счетом 2:1 по сумме двух матчей.
Харьковский «Металлист» выиграл со счетом 4:2 по сумме двух матчей.
«Портсмут» выиграл со счетом 4–2 по сумме двух матчей.
«Пари Сен-Жермен» выиграл со счетом 2:1 по сумме двух матчей.
«Севилья» выиграла со счетом 4:0 по сумме двух матчей.
«Вольфсбург» выиграл со счетом 2:1 по сумме двух матчей.
«Сампдория» выиграла со счетом 7:1 по сумме двух матчей.
Валенсия выиграла со счетом 3:1 по сумме двух матчей.
Динамо Загреб 3–3 Спарта Прага по сумме двух матчей. Динамо Загреб выиграло по правилу выездного гола.
«Манчестер Сити» выиграл со счетом 4–2 по сумме двух матчей.
«Брюгге» выиграл со счетом 4:2 по сумме двух матчей.
Нэнси выиграла со счетом 3–0 по сумме двух матчей.
«Стандард» Льеж выиграл со счетом 4–3 по сумме двух матчей.
«Бенфика» выиграла со счетом 4:3 по сумме двух матчей.
«Галатасарай» выиграл со счетом 6:4 по сумме двух матчей.
NEC выиграл со счетом 1:0 по сумме двух матчей.
«Расинг Сантандер» выиграл со счетом 2:0 по сумме двух матчей.