Сплайсосома — это большой рибонуклеопротеиновый (РНП) комплекс, обнаруженный преимущественно в ядре эукариотических клеток . Сплайсосома собирается из малых ядерных РНК ( мяРНК ) и многочисленных белков. Молекулы малых ядерных РНК (мяРНК) связываются со специфическими белками, образуя небольшой ядерный рибонуклеопротеиновый комплекс (мяРНП, произносится как «снурпс»), который, в свою очередь, объединяется с другими мяРНП, образуя большой рибонуклеопротеиновый комплекс, называемый сплайсосомой. Сплайсосома удаляет интроны из транскрибируемой пре-мРНК, типа первичного транскрипта . Этот процесс обычно называют сплайсингом . [1] Аналогией является монтажер фильма, который выборочно вырезает ненужный или неправильный материал (эквивалентный интронам ) из исходного фильма и отправляет очищенную версию режиссеру для окончательного монтажа.
Однако иногда РНК внутри интрона действует как рибозим, сплайсируя себя без использования сплайсосомы или белковых ферментов.
В 1977 году работа лабораторий Шарпа и Робертса показала, что гены высших организмов «разделены» или присутствуют в нескольких отдельных сегментах молекулы ДНК. [2] [3] Кодирующие области гена разделены некодирующей ДНК , которая не участвует в экспрессии белка. Расщепленная структура гена была обнаружена при гибридизации аденовирусных мРНК с фрагментами эндонуклеазного расщепления одноцепочечной вирусной ДНК. [2] Было замечено, что мРНК гибридов мРНК-ДНК содержали 5'- и 3'- концы областей, не связанных водородными связями. Когда использовались более крупные фрагменты вирусной ДНК, при гибридизации с вирусными мРНК наблюдались раздвоенные структуры ДНК с петлей. Было обнаружено, что закольцованные области, интроны , вырезаются из мРНК-предшественников в процессе, который Шарп назвал «сплайсингом». Впоследствии было обнаружено, что расщепленная структура гена является общей для большинства генов эукариот . Филип Шарп и Ричард Дж. Робертс были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 1993 года за открытие интронов и процесса сплайсинга.
Каждая сплайсосома состоит из пяти малых ядерных РНК (мяРНК) и ряда связанных с ними белковых факторов. Когда эти малые РНК объединяются с белковыми факторами, они образуют комплексы РНК-белок, называемые мяРНП ( малые ядерные рибонуклеопротеины , произносится как « снурпы »). МпРНК, составляющие основную сплайсосому, называются U1 , U2 , U4 , U5 и U6 , названы так потому, что они богаты уридином и участвуют в нескольких взаимодействиях РНК-РНК и РНК-белок. [1]
Сборка сплайсосомы происходит на каждой пре-мРНК (также известной как гетерогенная ядерная РНК, hn-РНК) на каждом соединении экзон:интрон. Интроны пре-мРНК содержат специфические элементы последовательности, которые распознаются и используются во время сборки сплайсосомы. К ним относятся 5'-концевой сайт сплайсинга, последовательность точки ветвления, полипиримидиновый тракт и 3'-концевой сайт сплайсинга. Сплайсосома катализирует удаление интронов и лигирование фланкирующих экзонов.
Интроны обычно имеют нуклеотидную последовательность GU на 5'-концевом сайте сплайсинга и AG на 3'-концевом сайте сплайсинга. 3'-сайт сплайсинга может дополнительно определяться полипиримидинами переменной длины, называемыми полипиримидиновым трактом (PPT), который выполняет двойную функцию: рекрутирования факторов в 3'-сайт сплайсинга и, возможно, рекрутирования факторов в последовательность точек ветвления (BPS). . BPS содержит консервативный аденозин, необходимый для первого этапа сплайсинга.
Многие белки обладают мотивом связывания цинка, что подчеркивает важность цинка в механизме сплайсинга. [4] [5] [6] О первой реконструкции комплекса тройного малого ядерного рибонуклеопротеина (три-мяРНП) U4/U6.U5 с молекулярным разрешением сообщалось в 2016 году. [7]
Крио-ЭМ широко применялся Ши и др. для выяснения около-/атомной структуры сплайсосомы как у дрожжей [9], так и у человека. [10] Молекулярная структура сплайсосомы с разрешением, близким к атомному, демонстрирует, что компонент Spp42 мяРНП U5 образует центральный каркас и закрепляет каталитический центр у дрожжей. Атомная структура сплайсосомы человека иллюстрирует, что компонент этапа II Slu7 принимает расширенную структуру, готовую к выбору 3'-сайта сплайсинга. Все пять металлов (обозначенные как Mg2+) дрожжевого комплекса сохраняются и в человеческом комплексе.
Альтернативный сплайсинг (рекомбинация разных экзонов ) является основным источником генетического разнообразия у эукариот. Варианты сплайсинга использовались для объяснения относительно небольшого количества генов , кодирующих белок, в геноме человека , которое в настоящее время оценивается примерно в 20 000. Предполагается, что один конкретный ген дрозофилы , Dscam , альтернативно сплайсируется в 38 000 различных мРНК , при условии, что все его экзоны могут сплайсироваться независимо друг от друга. [11]
Модель формирования активного центра сплайсосомы предполагает упорядоченную ступенчатую сборку дискретных частиц мяРНП на субстрате пре-мРНК. Первое распознавание пре-мРНК включает связывание мяРНП U1 с 5'-концевым сайтом сплайсинга пре-мРНК и другими факторами, не связанными с мяРНП, с образованием коммитентного комплекса или раннего (Е) комплекса у млекопитающих. [12] [13] Коммитирующий комплекс представляет собой АТФ-независимый комплекс, который связывает пре-мРНК с путем сплайсинга. [14] U2 snRNP рекрутируется в область разветвления посредством взаимодействия с компонентом E-комплекса U2AF (вспомогательный фактор U2 snRNP) и, возможно, U1 snRNP. В АТФ-зависимой реакции мяРНП U2 становится тесно связанным с последовательностью точки ветвления (BPS) с образованием комплекса А. Дуплекс, образующийся между мяРНП U2 и областью разветвления пре-мРНК, выпячивает аденозиновую ветвь, определяя его как нуклеофил для первая переэтерификация. [15]
Наличие остатка псевдоуридина в мяРНК U2, расположенного почти напротив места ветвления, приводит к изменению конформации дуплекса РНК-РНК при связывании мяРНП U2. В частности, измененная структура дуплекса, индуцированная псевдоуридином, помещает 2'-ОН выпуклого аденозина в благоприятное положение для первой стадии сплайсинга. [16] Три-мяРНП U4/U5/U6 (см. рисунок 1) участвует в сборке сплайсосомы с образованием комплекса B, а после нескольких перегруппировок комплекс C активируется для катализа. [17] [18] Неясно, как три-мяРНП рекрутируется в комплекс А, но этот процесс может быть опосредован посредством белок-белковых взаимодействий и/или взаимодействий спаривания оснований между мяРНК U2 и мяРНК U6.
мяРНП U5 взаимодействует с последовательностями в 5'- и 3'-сайтах сплайсинга через инвариантную петлю мяРНК U5 [19] , а белковые компоненты U5 взаимодействуют с областью 3'-сайта сплайсинга. [20]
При рекрутировании три-мяРНП первому каталитическому этапу предшествует несколько перегруппировок РНК-РНК, а дальнейшие перестройки происходят в каталитически активной сплайсосоме. Некоторые взаимодействия РНК-РНК являются взаимоисключающими; однако неизвестно, что запускает эти взаимодействия и порядок этих перестроек. Первой перестройкой, вероятно, является смещение мяРНП U1 из 5'-сайта сплайсинга и образование взаимодействия мяРНК U6. Известно, что мяРНП U1 слабо ассоциирован с полностью сформировавшимися сплайсосомами [21] , а мяРНП U1 ингибирует образование взаимодействия сайта сплайсинга U6-5' на модели субстратного олигонуклеотида, содержащего короткий 5'-экзон и 5'-конец. место сращивания. [22] Связывание мяРНП U2 с последовательностью точки ветвления (BPS) является одним из примеров взаимодействия РНК-РНК, вытесняющего взаимодействие белок-РНК. При рекрутировании мяРНП U2 белок SF1, связывающий ветку в коммитентном комплексе, смещается, поскольку сайт связывания мяРНК U2 и SF1 являются взаимоисключающими событиями.
Внутри мяРНК U2 существуют и другие взаимоисключающие перестройки, которые происходят между конкурирующими конформациями. Например, в активной форме предпочтительнее стволовая петля IIa; в неактивной форме преобладает взаимоисключающее взаимодействие между петлей и последующей последовательностью. [18] Неясно, как U4 вытесняется из мяРНК U6, хотя РНК участвует в сборке сплайсосом и может функционировать, раскручивая U4/U6 и способствуя образованию взаимодействия мяРНК U2/U6. Взаимодействия стволовых петель I и II U4/U6 диссоциируют, и освобожденная область стволовой петли II U6 складывается сама по себе, образуя внутримолекулярную стволовую петлю, и U4 больше не требуется для дальнейшей сборки сплайсосомы. Освобожденная область стебельковой петли I U6 пары оснований с мяРНК U2 образует спираль I U2/U6. Однако структура спирали I является взаимоисключающей с 3'-половиной внутренней 5'-области стволовой петли мяРНК U2.
У некоторых эукариот имеется вторая сплайсосома, так называемая минорная сплайсосома . [23] Группа менее распространенных мяРНК, U11 , U12 , U4atac и U6atac , вместе с U5, представляют собой субъединицы минорной сплайсосомы, которая сращивает редкий класс интронов пре-мРНК, обозначаемый как U12-тип. Минорная сплайсосома расположена в ядре, как и ее основной аналог [24] , хотя есть исключения в некоторых специализированных клетках, включая безъядерные тромбоциты [25] и дендроплазму ( дендритную цитоплазму) нейрональных клеток. [26]