Судебная серология — это обнаружение, идентификация, классификация и изучение различных телесных жидкостей, таких как кровь , сперма , слюна и моча , а также их связь с местом преступления. Судебный серолог может также участвовать в анализе ДНК и анализе пятен крови . [1] [2] Серологическое тестирование начинается с предположительных тестов , которые дают аналитику указание на то, что определенная телесная жидкость может присутствовать, но не могут полностью подтвердить ее присутствие. После предположительных тестов проводятся подтверждающие тесты на том же образце, чтобы подтвердить, что на самом деле представляет собой неизвестное вещество. [3]
Кровь состоит из жидкой плазмы и сыворотки с твердыми компонентами, состоящими из красных кровяных телец ( эритроцитов ), белых кровяных телец ( лейкоцитов ) и тромбоцитов ( тромбоцитов ). [4] Для обнаружения крови на месте преступления или в лаборатории можно использовать ряд тестов. Самым разрекламированным тестом криминальных шоу является процесс люминола , при котором химическое вещество распыляется на поверхность, где предположительно находится кровь. [4] Химическое вещество реагирует со следами крови, производя хемилюминесценцию или видимое свечение в результате происходящей химической реакции. Как и все предполагаемые тесты, этот метод может давать ложноположительные результаты из-за металлов и сильных химикатов, таких как отбеливатель, которые также будут реагировать. Другим распространенным предположительным тестом является тест Кастла-Мейера или фенолфталеиновый тест. Это каталитический тест, который обнаруживает в крови группу гема , которая переносит кислород и углекислый газ. [5] Стерильный ватный тампон смачивают в дистиллированной воде и прикладывают к области предполагаемой крови, чтобы собрать часть образца. [5] На тампон наносят одну каплю спирта, затем добавляют одну каплю реагента фенолфталеина, а затем одну каплю перекиси водорода. [6] Положительный результат вызывает изменение цвета на розовый. [4] Подобно тесту Кастла-Майера, гемастикс также является каталитическим тестом, упрощенным до специализированной полоски, где образец крови извлекается влажным тампоном и помещается непосредственно на гемастикс. [7] Положительный результат вызывает изменение цвета с желтого на темно-зеленый. [7]
Для подтверждающих тестов обычно используются Takayama Crystal Assay или иммунохроматографический тест. Takayama Crystal Assay, который образует ферропротопорфириновое кольцо в результате реакции между пиридином и атомом железа гемовой группы . [8] Реагент Такаяма добавляется к предметному стеклу с предполагаемым образцом крови. Предметное стекло высушивается при 115 градусах Цельсия после добавления реагента Такаяма. Затем его помещают под микроскоп, и положительным результатом является визуализация темно-красных, перистых кристаллов. [3] Для иммунохроматографического теста он функционирует аналогично тесту на беременность, где обнаруживаются антигены, присутствующие в крови, и положительным результатом является полоса в тестовом участке и контрольном участке. [9] После выполнения различных тестов аналитик может подтвердить наличие человеческой крови и продолжить разработку профиля ДНК с помощью последующих приложений, таких как извлечение ДНК , полимеразная цепная реакция (ПЦР), капиллярный электрофорез (КЭ) и т. д., с последующей интерпретацией профиля.
Сперма — это бесцветная жидкость, которая извергается из мужского полового члена в результате сексуального возбуждения . Для первоначального обнаружения спермы используется альтернативный источник света (ALS). [3] Под воздействием ультрафиолетового света сперма флуоресцирует, что делает ее видимой для следователей при сборе образцов с места преступления. Обычный предположительный тест для обнаружения спермы называется тестом на кислую фосфатазу (AP). [3] Тест на AP определяет фермент кислую фосфатазу, которая выделяется из предстательной железы. [4] Однако этот тест является только предположительным, поскольку кислая фосфатаза содержится в других жидкостях организма. [4] Для проведения теста капля реагента альфа-натрий-нафтифосфата добавляется к предполагаемому красителю, а затем капля быстрого синего B. Положительным результатом этого теста является изменение цвета на темно-фиолетовый. [4] [3]
Подтверждающие тесты для спермы включают окрашивание рождественской елкой и набор p30/PSA RSID. Для окрашивания рождественской елкой образец извлекается стерильной водой, чтобы сделать влажный препарат на предметном стекле микроскопа. Затем образец фиксируется на предметном стекле с помощью нагрева и окрашивается ядерным быстрым красным в течение 15 минут, затем промывается деионизированной водой. [8] Затем наносится зеленая краска на 10 секунд, затем промывается этанолом. Предметное стекло помещается под составной световой микроскоп для наблюдения за спермой. Если сперматозоиды присутствуют, головки окрашиваются в красный цвет, а средняя часть и хвост окрашиваются в зеленый цвет. [8] Однако не все самцы выделяют сперму в свою сперму. Если самец аспермик или олигоспермик, у него либо нет спермы, либо ее количество низкое. [10] Вазэктомированные самцы также не выделяют сперму. [4] Если сперматозоиды отсутствуют, проводится второй подтверждающий тест — тест p30/PSA. [3]
PSA(p30) известен как специфический антиген простаты , который вырабатывается предстательной железой у мужчин. [9] Тест p30/PSA представляет собой иммунохроматографический тест, который обнаруживает присутствие антигена p30 в образцах спермы. Этот тест функционирует аналогично тесту на беременность, где, если присутствует антиген p30, на месте теста появится полоса, а также появится контрольная полоса, подтверждающая, что тест работает правильно. [4] Если подтверждающий тест положительный, то в образце присутствует сперма. Отсюда аналитик может продолжить разработку профиля ДНК с последующими приложениями.
Предполагаемым тестом для обнаружения слюны является тест на альфа-амилазу, также известный как тест Фадебаса. [4] Этот метод обнаружения основан на активности фермента альфа-амилазы, который расщепляет крахмалы из пищи на более мелкие молекулы олигосахаридов, начиная пищеварение во рту. [11] Используя гель в чашке Петри, образец слюны добавляется и диффундирует через гель в течение ночи. Визуализация достигается путем добавления йода в гель, который окрашивает крахмал в геле в синий цвет. Если присутствует слюна, то альфа-амилаза расщепляет крахмал, создавая четкий цветной круг вокруг места, где был помещен образец. Тесты RSID также были сделаны для обнаружения альфа-амилазы, но они не всегда надежны, потому что может быть много ложноположительных результатов. [3]
Для подтверждающих тестов не было проведено столько исследований, как для крови и спермы. Поскольку эти тесты нацелены именно на амилазу, подтверждающие тесты не могут быть проведены, учитывая, что амилаза может быть обнаружена в других жидкостях организма. [12]
Предположительное обнаружение мочи может быть выполнено с помощью альтернативных источников света или теста на парадиметиламиноциннамальдегид (DMAC). [13] DMAC будет реагировать с мочевиной, мочевой кислотой или аммиаком, которые могут быть обнаружены в моче. [13] Когда образец с потенциальной мочой обнаружен, можно применить 0,1% DMAC. Если есть положительная реакция, на пятне будет присутствовать розовый/пурпурный цвет. [13] Существуют только предположительные тесты для обнаружения мочи, поскольку тесты использовали целевой материал, который может быть обнаружен в других жидкостях организма. Это может привести к множеству ложноположительных и неточных результатов. [13]
Тестирование различных жидкостей организма с помощью традиционных серологических методов, таких как перечисленные выше, возможно, но не без некоторых недостатков. Во-первых, не все жидкости организма имеют надежный подтверждающий тест, а те, которые имеют, обычно требуют большего количества подозреваемого пятна для проведения подтверждающего теста. Это может быть ограничивающим, если исследуемый судебный образец изначально мал. Кроме того, серология часто проводится до любых последующих анализов, таких как ДНК, поэтому, если образец ограничен по размеру, выполнение серологических анализов и получение профиля ДНК может оказаться невозможным. В настоящее время исследователи ищут способы идентификации жидкостей организма с большим успехом и меньшим количеством необходимых образцов, и новым способом сделать это является использование микроРНК.
МикроРНК ( miRNA ) — это небольшие некодирующие одноцепочечные РНК , которые используются для регуляции экспрессии генов путем регулирования трансляции (синтеза белка) или маркировки информационной РНК (мРНК) для деградации. [14] Учитывая их регуляторную роль, теория заключается в том, что различные miRNA будут присутствовать в разных количествах в определенных типах жидкости или ткани, поскольку каждый из этих типов тканей должен иметь уникальные белки и мРНК в зависимости от их роли в организме. MiRNA также являются идеальной целью для судебно-медицинского анализа, поскольку они малы по сравнению с другими клеточными компонентами, поэтому они, как правило, лучше сопротивляются деградации, чем другие маркеры тканей, что важно, учитывая, что образцы для работы по делу не всегда будут в первозданном состоянии. [14] Наконец, miRNA могут быть совместно извлечены и проанализированы одновременно с ДНК, объединяя два процесса в один для анализа биологических образцов, экономя время и образец.
miRNA можно извлечь с помощью ряда коммерчески доступных наборов, таких как набор Solid Phase QIAmp DNA mini. [15] В идеале, как и набор QIAmp, используемый метод извлечения способен извлекать ДНК и miRNA одновременно, сводя к минимуму количество реакций и количество используемого образца. miRNA можно количественно определить с помощью количественной ПЦР в реальном времени, аналогично традиционным образцам ДНК. [16] Однако для этого необходимо разработать праймеры и зонды для целевых miRNA. В отличие от рутинного профилирования ДНК , амплификация miRNA требует дополнительного шага перед процессом ПЦР. miRNA требует шага обратной транскрипции для преобразования фрагментов miRNA в их комплементарные фрагменты ДНК ( кДНК ). [15] После того, как это преобразование произошло, кДНК и другую ДНК в образце можно амплифицировать с помощью ПЦР , а затем разделить/визуализировать с помощью протокола капиллярного электрофореза. Для ваших целевых miRNA необходимо разработать специфические праймеры для кДНК. Конечным результатом является электрофореграмма, которая содержит не только профиль STR образца, но и пик, представляющий, какая miRNA присутствует в этом образце. [15]
Текущие потенциальные биомаркеры miRNA: Исследования все еще необходимы для сужения потенциальных биомаркеров, поскольку некоторые ткани и жидкости имеют одну и ту же miRNA, выраженную в разных концентрациях. На сегодняшний день miRNA крови и семенной жидкости были наиболее изучены и нашли многообещающие кандидаты на биомаркеры.
Подобно методу извлечения miRNA, исследователи смогли протестировать один или несколько образцов, извлекая ДНК и тестируя ее в инструменте, который есть в большинстве лабораторий. Этот метод доказал, что производит больше ДНК, чем амплификация на основе ПЦР. Исследователи также добавили другие факторы к петлевой изотермической амплификации, что позволяет идентифицировать различные жидкости организма. Использование LAMP сократило время, необходимое для получения результатов, что и было конечной целью. Хотя было доказано, что он сокращает общее и практическое время, необходимое для получения результата, все еще есть некоторые недочеты, которые необходимо проработать, прежде чем этот метод будет использоваться во многих или во всех судебно-медицинских лабораториях.