Аффинная хроматография — это метод разделения биомолекулы из смеси, основанный на высокоспецифичном макромолекулярном связывающем взаимодействии между биомолекулой и другим веществом. Конкретный тип связывающего взаимодействия зависит от интересующей биомолекулы; связывающие взаимодействия антигена и антитела , фермента и субстрата , рецептора и лиганда или белка и нуклеиновой кислоты [1] часто используются для выделения различных биомолекул. Аффинная хроматография полезна своей высокой селективностью и разрешением разделения, [2] [3] по сравнению с другими хроматографическими методами.
Аффинная хроматография имеет преимущество специфических связывающих взаимодействий между интересующим аналитом (обычно растворенным в подвижной фазе ) и связывающим партнером или лигандом (иммобилизованным на неподвижной фазе ). В типичном эксперименте по аффинной хроматографии лиганд прикрепляется к твердой нерастворимой матрице — обычно полимеру, такому как агароза или полиакриламид — химически модифицированной для введения реактивных функциональных групп , с которыми лиганд может реагировать, образуя стабильные ковалентные связи. [4] Неподвижная фаза сначала загружается в колонку, в которую вводится подвижная фаза. Молекулы, связывающиеся с лигандом, останутся связанными с неподвижной фазой. Затем применяется промывочный буфер для удаления нецелевых биомолекул путем нарушения их более слабых взаимодействий с неподвижной фазой, в то время как интересующие биомолекулы останутся связанными. Затем целевые биомолекулы могут быть удалены путем применения так называемого буфера элюирования, который нарушает взаимодействия между связанными целевыми биомолекулами и лигандом. Таким образом, целевая молекула восстанавливается в элюирующем растворе. [5] [ нужна страница ]
Аффинная хроматография не требует знания молекулярной массы, заряда, гидрофобности или других физических свойств интересующего аналита, хотя знание его связывающих свойств полезно при разработке протокола разделения. [5] Типы связывающих взаимодействий, обычно используемых в процедурах аффинной хроматографии, обобщены в таблице ниже.
Связывание с твердой фазой может быть достигнуто с помощью колоночной хроматографии, при которой твердая среда набивается на колонку, исходная смесь пропускается через колонку для осаждения, промывочный буфер пропускается через колонку, а буфер элюирования впоследствии наносится на колонку и собирается. Эти этапы обычно выполняются при давлении окружающей среды. В качестве альтернативы связывание может быть достигнуто с помощью пакетной обработки, например, путем добавления исходной смеси к твердой фазе в сосуде, смешивания, разделения твердой фазы, удаления жидкой фазы, промывки, повторного центрифугирования, добавления буфера элюирования, повторного центрифугирования и удаления элюата.
Иногда применяется гибридный метод, при котором связывание осуществляется пакетным методом, но твердая фаза со связанной целевой молекулой набивается в колонку, а промывка и элюирование производятся на колонке.
Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают из органических и неорганических источников. Примерами биологических источников являются сывороточные белки, лектины и антитела. Неорганическими источниками являются мороновая кислота, хелаты металлов и триазиновые красители. [7]
Также был разработан третий метод, абсорбция в расширенном слое, который объединяет преимущества двух вышеупомянутых методов. Частицы твердой фазы помещаются в колонну, куда жидкая фаза закачивается снизу и выходит сверху. Гравитация частиц гарантирует, что твердая фаза не выйдет из колонны вместе с жидкой фазой.
Аффинные колонки можно элюировать , изменяя концентрацию соли, pH, pI, заряд и ионную силу напрямую или с помощью градиента для разделения интересующих частиц.
Совсем недавно были разработаны установки, использующие более одной колонки последовательно. Преимущество по сравнению с установками с одной колонкой заключается в том, что материал смолы может быть полностью загружен, поскольку несвязанный продукт напрямую передается в последующую колонку со свежим материалом колонки. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (PCC). Таким образом, затраты смолы на количество произведенного продукта могут быть радикально снижены. Поскольку одну колонку всегда можно элюировать и регенерировать, пока другая колонка загружена, уже двух колонок достаточно, чтобы в полной мере использовать преимущества. [8] Дополнительные колонки могут обеспечить дополнительную гибкость для времени элюирования и регенерации за счет дополнительного оборудования и затрат на смолу.
Аффинную хроматографию можно использовать в ряде приложений, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков [9] из бесклеточных экстрактов и очистку из крови.
Используя аффинную хроматографию, можно отделить белки, которые связываются с определенным фрагментом, от белков, которые не связываются с этим конкретным фрагментом. [10] Поскольку этот метод очистки основан на биологических свойствах необходимого белка, он является полезным, и белки можно очищать многократно за один шаг. [11] [ нужна страница ]
Существует множество различных аффинных сред для различных возможных применений. [12] [9] [13] Вкратце, они (обобщенно) активированы/функционализированы, которые работают как функциональный спейсер, поддерживающая матрица и исключают необходимость работы с токсичными реагентами.
Аминокислотная среда используется с различными сывороточными белками, белками, пептидами и ферментами, а также рРНК и дцДНК. Авидин-биотиновая среда используется в процессе очистки биотина/авидина и их производных.
Связывание углеводов чаще всего используется с гликопротеинами или любыми другими углеводсодержащими веществами; углеводы используются с лектинами, гликопротеинами или любыми другими углеводными метаболитными белками. Среда с красителем-лигандом неспецифична, но имитирует биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, помеченных GST. Гепарин является обобщенным аффинным лигандом и наиболее полезен для разделения белков коагуляции плазмы, а также ферментов нуклеиновых кислот и липаз
Среды гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для воздействия на свободные карбоксильные группы и белки.
Иммуноаффинная среда (подробно описана ниже) использует высокую специфичность антигенов и антител для разделения; аффинная хроматография с иммобилизованными металлами подробно описана ниже и использует взаимодействия между ионами металлов и белками (обычно специально помеченными) для разделения; нуклеотид/кофермент, который разделяет дегидрогеназы, киназы и трансаминазы.
Нуклеиновые кислоты выполняют функцию захвата мРНК, ДНК, рРНК и других нуклеиновых кислот/олигонуклеотидов. Метод белка A/G используется для очистки иммуноглобулинов.
Специальные среды предназначены для определенного класса или типа белка/коферола; этот тип сред подойдет только для разделения определенного белка или кофермента.
Другое применение процедуры — аффинная очистка антител из сыворотки крови. Если известно, что сыворотка содержит антитела против определенного антигена (например, если сыворотка получена от организма, иммунизированного против соответствующего антигена), то ее можно использовать для аффинной очистки этого антигена. Это также известно как иммуноаффинная хроматография. Например, если организм иммунизирован против белка слияния GST, он будет вырабатывать антитела против белка слияния и, возможно, также антитела против метки GST. Затем белок можно ковалентно связать с твердой подложкой, такой как агароза, и использовать в качестве аффинного лиганда при очистке антител из иммунной сыворотки.
Для полноты анализа белок GST и белок слияния GST можно соединять по отдельности. Сначала сыворотке дают возможность связаться с матрицей сродства GST. Это удалит антитела против части белка слияния GST. Затем сыворотку отделяют от твердой подложки и дают возможность связаться с матрицей белка слияния GST. Это позволяет любым антителам, распознающим антиген, быть захваченными на твердой подложке. Элюирование интересующих антител чаще всего достигается с использованием буфера с низким pH, такого как глицин pH 2,8. Элюат собирается в нейтральный трис или фосфатный буфер, чтобы нейтрализовать буфер элюирования с низким pH и остановить любую деградацию активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного белка слияния GST, чтобы удалить нежелательные антитела против GST из сыворотки и очистить целевое антитело.
Моноклональные антитела также могут быть выбраны для связывания белков с большой специфичностью, где белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может стать полезным для дальнейших исследований в будущем. [14]
Упрощенная стратегия часто используется для очистки антител, полученных против пептидных антигенов . Когда пептидные антигены производятся синтетически, терминальный остаток цистеина добавляется либо на N-, либо на C-конец пептида. Этот остаток цистеина содержит сульфгидрильную функциональную группу, которая позволяет пептиду легко конъюгироваться с белком-носителем (например, гемоцианином лимфы улитки (KLH)). Тот же самый пептид, содержащий цистеин, также иммобилизуется на агарозной смоле через остаток цистеина и затем используется для очистки антитела.
Большинство моноклональных антител были очищены с помощью аффинной хроматографии на основе иммуноглобулин -специфического белка А или белка G , полученного из бактерий. [15]
Иммуноаффинная хроматография с моноклональными антителами, иммобилизованными на монолитной колонке, успешно применялась для захвата внеклеточных везикул (например, экзосом и экзомеров) из плазмы крови человека путем воздействия на тетраспанины и интегрины, обнаруженные на поверхности ВВ. [16] [17]
Иммуноаффинная хроматография также является основой для иммунохроматографических тестовых полосок (ICT), которые обеспечивают быструю диагностику при уходе за пациентами. Используя ICT, лаборант может сделать определение у постели пациента, без необходимости в лаборатории. [18] Обнаружение ICT высокоспецифично для микроба, вызывающего инфекцию. [19]
Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) основана на специфической координатной ковалентной связи аминокислот, в частности гистидина, с металлами. Этот метод работает, позволяя белкам с сродством к ионам металлов удерживаться в колонке, содержащей иммобилизованные ионы металлов, такие как кобальт, никель или медь для очистки содержащих гистидин белков или пептидов, железо, цинк или галлий для очистки фосфорилированных белков или пептидов. Многие встречающиеся в природе белки не имеют сродства к ионам металлов, поэтому технология рекомбинантной ДНК может быть использована для введения такой белковой метки в соответствующий ген. Методы, используемые для элюирования интересующего белка, включают изменение pH или добавление конкурентной молекулы, такой как имидазол . [20] [21]
Возможно, наиболее распространенное применение аффинной хроматографии — очистка рекомбинантных белков. Белки с известным сродством маркируются белками для облегчения их очистки. Белок может быть генетически модифицирован, чтобы его можно было выбрать для аффинного связывания; это известно как белок слияния. Белковые метки включают гексагистидин ( His ), глутатион -S-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу (MBP), и вариант метки Colicin E7 CL7. Гистидиновые метки имеют сродство к ионам никеля , кобальта , цинка , меди и железа , которые были иммобилизованы путем образования координационных ковалентных связей с хелатором, включенным в неподвижную фазу. Для элюирования используется избыточное количество соединения, способного действовать как лиганд иона металла, такого как имидазол . GST имеет сродство к глутатиону, который коммерчески доступен в виде иммобилизованной глутатионовой агарозы. Во время элюирования избыток глутатиона используется для вытеснения меченого белка. CL7 имеет сродство и специфичность к иммунологическому белку 7 (Im7), который коммерчески доступен в виде иммобилизованной агарозной смолы Im7. Для элюирования активная и сайт-специфическая протеаза применяется к смоле Im7 для высвобождения белка без метки. [22]
Аффинная хроматография с лектином — это форма аффинной хроматографии, в которой лектины используются для разделения компонентов в образце. Лектины, такие как конканавалин А, представляют собой белки, которые могут связывать специфические молекулы углеводов альфа-D-маннозы и альфа-D-глюкозы. Некоторые распространенные молекулы углеводов, которые используются в аффинной хроматографии с лектином, — это Con A-сефароза и WGA-агароза. [23] Другим примером лектина является агглютинин зародышей пшеницы, который связывает DN-ацетилглюкозамин. [24] Наиболее распространенным применением является отделение гликопротеинов от негликозилированных белков или одной гликоформы от другой гликоформы. [25] Хотя существуют различные способы проведения аффинной хроматографии с лектином, целью является извлечение сахарного лиганда желаемого белка. [23]
Другое применение аффинной хроматографии — очистка определенных белков с использованием гелевой матрицы, которая уникальна для определенного белка. Например, очистка β-галактозидазы E. coli осуществляется с помощью аффинной хроматографии с использованием p-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозил агарозы в качестве аффинной матрицы. p-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозил агарозы используется в качестве аффинной матрицы, поскольку она содержит галактопиранозильную группу, которая служит хорошим аналогом субстрата для β-галактозидазы E. coli. Это свойство позволяет ферменту связываться со стационарной фазой аффинной матрицы, и β-галактозидаза элюируется путем добавления возрастающих концентраций соли в колонку. [26]
Щелочную фосфатазу из E. coli можно очистить с помощью матрицы DEAE-целлюлозы. A. фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать, добавляя буфер с более высокой концентрацией соли. [27]
Аффинная хроматография с боронатом заключается в использовании бороновой кислоты или боронатов для элюирования и количественного определения количества гликопротеинов . Клинические адаптации использовали этот тип хроматографии для определения долгосрочной оценки пациентов с диабетом посредством анализа их гликированного гемоглобина . [24]
Аффинная очистка альбумина и макроглобулиновых загрязнений полезна для удаления избытка альбумина и α 2 -макроглобулиновых загрязнений при проведении масс-спектрометрии. При аффинной очистке сывороточного альбумина стационарным веществом, используемым для сбора или привлечения сывороточных белков, может быть Cibacron Blue-Sepharose. Затем сывороточные белки могут быть элюированы из адсорбента буфером, содержащим тиоцианат (SCN − ). [28]
Слабая аффинная хроматография [29] ( WAC ) — это метод аффинной хроматографии для аффинного скрининга при разработке лекарств. [30] [31] WAC — это метод жидкостной хроматографии на основе аффинности , который разделяет химические соединения на основе их различного слабого сродства к иммобилизованной мишени. Чем выше сродство соединения к мишени, тем дольше оно остается в разделительной единице, и это будет выражаться в виде более длительного времени удерживания. Мера сродства и ранжирование сродства могут быть достигнуты путем обработки полученных времен удерживания анализируемых соединений. Аффинная хроматография является частью более обширного набора методов, используемых при идентификации мишени лекарственных средств на основе хемопротеомики .
Технология WAC продемонстрирована против ряда различных белковых мишеней – протеаз , киназ , шаперонов и мишеней белок-белкового взаимодействия (PPI). Было показано, что WAC более эффективен, чем установленные методы скрининга на основе фрагментов. [31]
Аффинная хроматография была задумана и впервые разработана Педро Куатрекасасом и Меиром Вильчеком . [32] [33]
хроматография — это новый метод, разработанный Куатрекасасом и Вильчеком.