stringtranslate.com

Тандемный тег массы

В аналитической химии тандемная массовая метка ( TMT ) представляет собой химическую метку, которая облегчает мультиплексирование образцов при количественной оценке и идентификации биологических макромолекул, таких как белки , пептиды и нуклеиновые кислоты , на основе масс-спектрометрии (МС) . TMT принадлежит к семейству реагентов, называемых изобарическими массовыми метками , которые представляют собой набор молекул с одинаковой массой, но дают репортерные ионы различной массы после фрагментации. Относительное соотношение измеренных репортерных ионов представляет собой относительное обилие меченой молекулы, хотя подавление ионов оказывает пагубное влияние на точность. [1] [2] Несмотря на эти осложнения, было показано, что протеомика на основе TMT обеспечивает более высокую точность, чем количественная оценка без меток . [3] Помимо помощи в количественной оценке белков, метки TMT также могут повышать чувствительность обнаружения некоторых высокогидрофильных аналитов, таких как фосфопептиды, в анализах RPLC -MS. [4]

Версии

В настоящее время доступно шесть разновидностей TMT: TMTzero, неизотопно замещенная основная структура; TMTduplex, изобарный пара массовых меток с одним изотопным замещением; [5] TMTsixplex, изобарный набор из шести массовых меток с пятью изотопными замещениями; [6] [ необходим непервичный источник ] TMT 10-plex — набор из 10 изотопных массовых меток, которые используют репортерную область TMTsixplex, но используют другой элементарный изотоп для создания разницы масс 0,0063 Да, [7] [ необходим непервичный источник ] TMTpro — 16-плексная версия с другим репортером и нормализатором масс, чем у оригинального TMT, и TMTpro Zero.

Теги содержат четыре области, а именно область массового репортера (M), расщепляемую область линкера (F), область нормализации массы (N) и группу, реагирующую с белком (R). Химические структуры всех тегов идентичны, но каждая содержит изотопы, замещенные в различных положениях, так что области массового репортера и нормализации массы имеют разные молекулярные массы в каждой метке. Объединенные области MFNR тегов имеют одинаковые общие молекулярные массы и структуру, так что во время хроматографического или электрофоретического разделения и в режиме одиночной МС молекулы, помеченные разными тегами, неразличимы. При фрагментации в режиме МС/МС информация о последовательности получается из фрагментации пептидного остова , а данные количественной оценки одновременно получаются из фрагментации тегов, что приводит к образованию ионов массового репортера.

Количественное определение меченых пептидов

Структуры тегов TMT общедоступны через базу данных unimod на unimod.org, и, следовательно, программное обеспечение для масс-спектрометрии, такое как Mascot, способно учитывать массы тегов. Кроме того, начиная с версии 2.2, Mascot имеет возможность количественной оценки с использованием тегов TMT и других изобарных масс без использования дополнительного программного обеспечения. Интуитивно понятно, что доверие, связанное с измерением белка, зависит от сходства соотношений разных пептидов и уровня сигнала этих измерений. Появился математически строгий подход, называемый BACIQ, который объединяет интенсивности пептидов и согласие измерений пептидов в доверительные интервалы для соотношений белков. [8] Стандарт TKO может использоваться для оценки помех [9] [ необходим непервичный источник ]

Концепция изобарного носителя

Метки TMT обычно используются для маркировки образцов с одинаковой распространенностью. Однако, если один из маркированных образцов более распространен, это может повысить чувствительность анализа для всех образцов. [10] Такие изобарически маркированные образцы называются изобарическими носителями. Они были введены для анализа белков отдельных клеток методом масс-спектрометрии, [11] и нашли множество других применений. [12]

Ссылки

  1. ^ O'Brien JJ, O'Connell JD, Paulo JA, Thakurta S, Rose CM, Weekes MP и др. (январь 2018 г.). «Композиционная протеомика: влияние пространственных ограничений на количественную оценку белка с использованием изобарных меток». Журнал исследований протеома . 17 (1): 590–599. doi :10.1021/acs.jproteome.7b00699. PMC  5806995. PMID  29195270.
  2. ^ Бренес А., Хукельманн Дж., Бенсаддек Д., Ламонд А.И. (октябрь 2019 г.). «Многопартионный TMT выявляет ложные положительные результаты, эффекты партии и пропущенные значения». Молекулярная и клеточная протеомика . 18 (10): 1967–1980. doi : 10.1074/mcp.RA119.001472 . PMC 6773557. PMID  31332098 . 
  3. ^ O'Connell JD, Paulo JA, O'Brien JJ, Gygi SP (май 2018 г.). «Оценка двух распространенных методов количественной оценки белков по всему протеому». Журнал исследований протеома . 17 (5): 1934–1942. doi :10.1021/acs.jproteome.8b00016. PMC 5984592. PMID  29635916 . 
  4. ^ Tsai CF, Smith JS, Krajewski K, Zhao R, Moghieb AM, Nicora CD и др. (сентябрь 2019 г.). «Тандемная массовая метка облегчает анализ гидрофильных фосфопептидов методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии». Аналитическая химия . 91 (18): 11606–11613. doi :10.1021/acs.analchem.9b01814. PMC 7197904 . PMID  31418558. 
  5. ^ Томпсон А., Шефер Дж., Кун К., Кинле С., Шварц Дж., Шмидт Г. и др. (апрель 2003 г.). «Тандемные массовые метки: новая стратегия количественной оценки для сравнительного анализа сложных белковых смесей с помощью МС/МС». Аналитическая химия . 75 (8): 1895–904. doi :10.1021/ac0262560. PMID  12713048.
  6. ^ Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF и др. (апрель 2008 г.). «Относительное количественное определение белков в спинномозговой жидкости человека методом МС/МС с использованием 6-плексных изобарических меток». Аналитическая химия . 80 (8): 2921–31. doi :10.1021/ac702422x. PMID  18312001.
  7. ^ Werner T, Sweetman G, Savitski MF, Mathieson T, Bantscheff M, Savitski MM (апрель 2014 г.). «Ионная коалесценция нейтронно-кодированных репортерных ионов TMT 10-plex». Аналитическая химия . 86 (7): 3594–601. doi :10.1021/ac500140s. PMID  24579773.
  8. ^ Пешкин, Л.; Рязанова, Л.; Вур, М.; и др. (2017). «Байесовские доверительные интервалы для мультиплексной протеомики интегрируют ионную статистику с согласованностью количественной оценки пептидов». bioRxiv 10.1101/210476 . 
  9. ^ Paulo JA, O'Connell JD, Gygi SP (октябрь 2016 г.). «Стандарт протеомики с тройным нокаутом (TKO) для диагностики ионной интерференции в экспериментах по изобарной маркировке». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 27 (10): 1620–5. Bibcode : 2016JASMS..27.1620P. doi : 10.1007/s13361-016-1434-9. PMC 5018445. PMID  27400695 . 
  10. ^ Шпехт Х, Славов Н (январь 2021 г.). «Оптимизация точности и глубины количественной оценки белка в экспериментах с использованием изобарных носителей». Журнал исследований протеома . 20 (1): 880–887. doi :10.1021/acs.jproteome.0c00675. PMC 7775882. PMID  33190502 . 
  11. ^ Будник Б., Леви Э., Харманж Г., Славов Н. (октябрь 2018 г.). «SCoPE-MS: масс-спектрометрия отдельных клеток млекопитающих количественно определяет гетерогенность протеома во время дифференциации клеток». Genome Biology . 19 (1): 161. doi : 10.1186/s13059-018-1547-5 . PMC 6196420 . PMID  30343672. 
  12. ^ Славов Н (февраль 2021 г.). «Анализ белков отдельных клеток методом масс-спектрометрии». Current Opinion in Chemical Biology . 60 : 1–9. arXiv : 2004.02069 . doi : 10.1016/j.cbpa.2020.04.018. PMC 7767890. PMID  32599342 .