Квантификация без меток — это метод масс-спектрометрии , целью которого является определение относительного количества белков в двух или более биологических образцах. В отличие от других методов количественной оценки белков , количественная оценка без меток не использует соединение, содержащее стабильный изотоп, для химического связывания с белком и, таким образом, его маркировки. [1] [2]
Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала предшественника или на спектральном подсчете . Первый метод полезен при применении к высокоточным масс-спектрам, например, полученным с использованием нового поколения времяпролетных ( ToF), ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR) или масс-анализаторов Orbitrap . Высокая разрешающая способность облегчает извлечение сигналов пептидов на уровне MS 1 и, таким образом, отделяет количественную оценку от процесса идентификации. Напротив, спектральный подсчет просто подсчитывает количество спектров, идентифицированных для данного пептида в различных биологических образцах, а затем интегрирует результаты для всех измеренных пептидов белка(ов), которые количественно определены.
Вычислительная структура подхода без меток включает обнаружение пептидов, сопоставление соответствующих пептидов с несколькими данными ЖХ-МС, выбор дискриминационных пептидов. [3] [4]
Спектрометрия экспрессии интактного белка (IPEx) — это метод количественной оценки без использования меток в масс-спектрометрии, разрабатываемый аналитической химией в Центре по безопасности пищевых продуктов и прикладному питанию Управления по контролю за продуктами и лекарствами США и другими организациями. Интактные белки анализируются с помощью прибора LCMS , обычно квадрупольного времяпролетного режима в режиме профиля, а полный профиль белка определяется и количественно оценивается с помощью программного обеспечения для обработки данных. Первые результаты весьма обнадеживают. В одном исследовании две группы повторов лечения из образцов млекопитающих (разные организмы со схожей историей лечения, но не технические повторы) показывают десятки биомаркеров белка с низким CV, что позволяет предположить, что IPEx является жизнеспособной технологией для изучения экспрессии белка. [5]
Обычно сигналы пептидов обнаруживаются на уровне MS1 и отличаются от химического шума по их характерному изотопному шаблону. Затем эти шаблоны отслеживаются по измерению времени удерживания и используются для реконструкции профиля хроматографического элюирования моноизотопной пептидной массы. Затем общий ионный ток пептидного сигнала интегрируется и используется в качестве количественного измерения исходной концентрации пептида. Для каждого обнаруженного пептида сначала находятся все изотопные пики, а затем назначается зарядовое состояние.
Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала предшественника и имеет проблемы из-за помех изоляции: в высокопроизводительных исследованиях идентичность измеряемого иона предшественника пептида может легко оказаться совершенно другим пептидом с похожим соотношением m/z, который элюируется во временном интервале, перекрывающемся с таковым у предыдущего пептида. Спектральный подсчет имеет проблемы из-за того, что пептиды идентифицируются, что делает необходимым проведение дополнительного сканирования MS/MS, которое занимает время и, следовательно, снижает разрешение эксперимента.
В отличие от дифференциальной маркировки, каждый биологический образец необходимо измерять отдельно в эксперименте без метки. Извлеченные сигналы пептидов затем картируются по нескольким или нескольким измерениям ЖХ-МС с использованием их координат в измерениях массы к заряду и времени удерживания. Данные с высокоточных приборов для измерения массы значительно облегчают этот процесс и повышают уверенность в сопоставлении правильных сигналов пептидов в разных запусках.
Очевидно, что дифференциальная обработка биологических образцов требует наличия стандарта, который можно использовать для корректировки результатов. Пептиды, которые, как ожидается, не изменят уровень экспрессии в различных биологических образцах, могут быть использованы для этой цели. Однако не все пептиды хорошо ионизируются, и поэтому выбор кандидатов должен осуществляться после первоначального исследования, которое должно характеризовать только содержание белка в биологических образцах, которые будут исследоваться.
Наконец, сложные методы нормализации используются для удаления систематических артефактов в значениях интенсивности пептидов между измерениями ЖХ-МС. Затем дискриминационные пептиды идентифицируются путем выбора пептидов, нормализованные интенсивности которых различаются (например, p-value < 0,05) среди нескольких групп образцов.
Кроме того, более новые гибридные масс-спектрометры, такие как LTQ OrbiTrap, предлагают возможность получения пептидных идентификаций MS/MS параллельно с высокоточным измерением массы пептидов на уровне MS1. Это повышает вычислительную сложность для обработки и интеграции этих двух источников информации и привело к разработке новых многообещающих стратегий количественной оценки.