Микроскопия темного поля (также называемая микроскопией темного поля ) описывает методы микроскопии , как в световой , так и в электронной микроскопии , которые исключают нерассеянный луч из изображения. Следовательно, поле вокруг образца (т. е. там, где нет образца, рассеивающего луч ), обычно темное.
В оптических микроскопах необходимо использовать темнопольную конденсорную линзу, которая направляет конус света от объектива. Чтобы максимизировать светосилу объектива, собирающего рассеянный свет, используется масляная иммерсия, а числовая апертура (ЧА) объектива должна быть меньше 1,0. Объективы с более высокой числовой апертурой можно использовать, но только в том случае, если они имеют регулируемую диафрагму, которая уменьшает числовую апертуру. Зачастую числовая апертура этих объективов варьируется от 0,7 до 1,25. [1]
В оптической микроскопии тёмное поле описывает метод освещения , используемый для усиления контраста в неокрашенных образцах . Он работает путем освещения образца светом, который не улавливается линзой объектива и, следовательно, не образует часть изображения. Это создает классический вид темного, почти черного фона с яркими объектами на нем.
Этапы показаны на рисунке, где используется инвертированный микроскоп .
Темнопольная микроскопия — очень простой, но эффективный метод, хорошо подходящий для использования живых и неокрашенных биологических образцов, таких как мазки тканевой культуры или отдельных одноклеточных организмов, переносимых водой. Учитывая простоту установки, качество изображений, полученных с помощью этого метода, впечатляет.
Одним из ограничений темнопольной микроскопии является низкий уровень освещенности, видимый на конечном изображении. Это означает, что образец должен быть очень сильно освещен, что может привести к его повреждению.
Методы темнопольной микроскопии почти полностью лишены ореолов или артефактов в виде рельефа, типичных для ДВС-синдрома и фазово-контрастных изображений. Это происходит за счет чувствительности к фазовой информации.
Интерпретацию темнопольных изображений следует выполнять с большой осторожностью, поскольку общие темные особенности изображений, полученных при микроскопии светлого поля, могут быть невидимыми, и наоборот. В целом, в изображении в темном поле отсутствуют низкие пространственные частоты , присущие изображению в светлом поле, что делает изображение высокочастотной версией базовой структуры.
Хотя изображение в темном поле может сначала показаться негативом изображения в светлом поле, в каждом из них видны разные эффекты. При микроскопии светлого поля видны особенности, в которых либо тень отбрасывается на поверхность падающим светом, либо часть поверхности менее отражающая, возможно, из-за наличия ямок или царапин. Выпуклые объекты, которые слишком гладкие, чтобы отбрасывать тени, не будут отображаться на изображениях в светлом поле, но свет, отражающийся от сторон объекта, будет виден на изображениях в темном поле.
Темнопольная микроскопия недавно была применена в манипуляторах компьютерной мыши, чтобы позволить мыши работать с прозрачным стеклом, визуализируя микроскопические дефекты и пыль на поверхности стекла.
В сочетании с гиперспектральной визуализацией темнопольная микроскопия становится мощным инструментом для характеристики наноматериалов , встроенных в клетки. В недавней публикации Пацковский и др. использовали этот метод для изучения прикрепления наночастиц золота (AuNP), нацеленных на CD44 + раковые клетки. [2]
Темнопольные исследования в просвечивающей электронной микроскопии играют важную роль при изучении кристаллов и кристаллических дефектов, а также при визуализации отдельных атомов.
Вкратце, визуализация [3] включает в себя наклон падающего освещения до тех пор, пока дифрагированный, а не падающий луч не пройдет через небольшую апертуру объектива в задней фокальной плоскости объектива. Темнопольные изображения в этих условиях позволяют отображать дифрагированную интенсивность, исходящую от одной совокупности дифрагирующих плоскостей, как функцию проекции положения на образце и как функцию наклона образца.
В монокристаллических образцах темнопольные изображения образца, наклоненного в непосредственной близости от условия Брэгга, позволяют «подсветить» только те дефекты решетки, такие как дислокации или выделения, которые изгибают один набор плоскостей решетки в их окрестностях. . Анализ интенсивности таких изображений может затем использоваться для оценки величины этого изгиба. С другой стороны, в поликристаллических образцах темнопольные изображения служат для освещения только той подгруппы кристаллов, которая обладает брэгговским отражением при данной ориентации.
Визуализация слабым лучом включает в себя оптику, аналогичную обычной темному полю, но использует гармонику дифрагированного луча , а не сам дифрагированный луч. Таким образом можно получить гораздо более высокое разрешение напряженных областей вокруг дефектов.
Кольцевая визуализация в темном поле требует формирования изображений с электронами, дифрагированными в кольцевую апертуру, центрированную на нерассеянном луче, но не включая его. Для больших углов рассеяния в сканирующем просвечивающем электронном микроскопе это иногда называют Z -контрастным изображением из-за усиленного рассеяния на атомах с большим атомным номером.
Это математический метод, промежуточный между прямым и обратным (преобразование Фурье) пространством для исследования изображений с четко определенной периодичностью, таких как изображения решетчатых полос электронного микроскопа. Как и в случае с аналоговой визуализацией в темном поле в просвечивающем электронном микроскопе, она позволяет «осветить» те объекты в поле зрения, где находятся интересующие периодичности. В отличие от аналоговых изображений в темном поле, это также может позволить составить карту Фурье-фазы периодичностей и, следовательно, фазовых градиентов, которые предоставляют количественную информацию о векторной деформации решетки.
