Микроскопия темного поля (также называемая микроскопией темного поля ) описывает методы микроскопии , как в световой , так и в электронной микроскопии , которые исключают нерассеянный луч из изображения. Следовательно, поле вокруг образца (т. е. там, где нет образца, рассеивающего луч) обычно темное.
В оптических микроскопах необходимо использовать линзу темного поля конденсора , которая направляет конус света от объектива. Чтобы максимизировать рассеивающую световую силу объектива, используется масляная иммерсия, а числовая апертура (NA) объектива должна быть меньше 1,0. Объективы с более высокой NA могут использоваться, но только если они имеют регулируемую диафрагму, которая уменьшает NA. Часто эти объективы имеют NA, которая варьируется от 0,7 до 1,25. [1]
В оптической микроскопии темное поле описывает метод освещения, используемый для усиления контраста в неокрашенных образцах . Он работает путем освещения образца светом, который не будет собран объективной линзой и, таким образом, не будет являться частью изображения. Это создает классический вид темного, почти черного фона с яркими объектами на нем. Оптические темные поля обычно создаются с помощью конденсора, который имеет центральную светопреломляющую остановку перед источником света для предотвращения прямого освещения фокальной плоскости, и при более высоких числовых апертурах может потребоваться масло или вода между конденсором и предметным стеклом образца для обеспечения оптимального показателя преломления . [2] [3]
Этапы проиллюстрированы на рисунке, где используется инвертированный микроскоп .
Микроскопия темного поля — очень простая, но эффективная техника, хорошо подходящая для использования с живыми и неокрашенными биологическими образцами, такими как мазок из культуры тканей или отдельные, переносимые водой, одноклеточные организмы. Учитывая простоту установки, качество изображений, полученных с помощью этой техники, впечатляет.
Одним из ограничений темнопольной микроскопии является низкий уровень освещенности, видимый на конечном изображении. Это означает, что образец должен быть очень сильно освещен, что может привести к его повреждению.
Методы микроскопии темного поля практически полностью свободны от артефактов в виде гало или рельефа, типичных для микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом . Это происходит за счет чувствительности к фазовой информации.
Интерпретация изображений темного поля должна проводиться с большой осторожностью, поскольку обычные темные особенности изображений светлого поля микроскопии могут быть невидимыми, и наоборот. В целом, изображение темного поля не имеет низких пространственных частот, связанных с изображением светлого поля, что делает изображение высокочастотной версией базовой структуры.
Хотя темнопольное изображение может сначала показаться негативом светлопольного изображения, в каждом из них видны разные эффекты. В светлопольной микроскопии особенности видны там, где либо тень отбрасывается на поверхность падающим светом, либо часть поверхности имеет меньшую отражательную способность, возможно, из-за наличия ямок или царапин. Выпуклые особенности, которые слишком гладкие, чтобы отбрасывать тени, не будут видны на светлопольных изображениях, но свет, который отражается от сторон особенности, будет виден на темнопольных изображениях.
Темнопольная микроскопия недавно была применена в манипуляторах типа компьютерной мыши, что позволило мыши работать на прозрачном стекле, визуализируя микроскопические дефекты и пыль на поверхности стекла.
В сочетании с гиперспектральной визуализацией темнопольная микроскопия становится мощным инструментом для характеристики наноматериалов, встроенных в клетки. В недавней публикации Пацковски и др. использовали эту технику для изучения прикрепления золотых наночастиц (AuNP), нацеленных на раковые клетки CD44 +. [4]
Исследования в темном поле в просвечивающей электронной микроскопии играют важную роль в изучении кристаллов и дефектов кристаллов, а также в визуализации отдельных атомов.
Вкратце, визуализация [5] включает наклон падающего освещения до тех пор, пока дифрагированный, а не падающий луч не пройдет через маленькое объективное отверстие в задней фокальной плоскости объектива. Темнопольные изображения в этих условиях позволяют отображать дифрагированную интенсивность, исходящую от одного набора дифрагирующих плоскостей, как функцию проецируемого положения на образце и как функцию наклона образца.
В монокристаллических образцах темнопольные изображения с однократным отражением образца, наклоненного немного в сторону от условия Брэгга, позволяют «осветить» только те дефекты решетки, такие как дислокации или выделения, которые изгибают один набор плоскостей решетки в их окрестности. Анализ интенсивностей на таких изображениях может затем использоваться для оценки величины этого изгиба. В поликристаллических образцах, с другой стороны, темнопольные изображения служат для освещения только того подмножества кристаллов, которые являются брэгговскими отражениями при данной ориентации.
Визуализация слабым пучком использует оптику, похожую на обычную темную область, но использует гармонику дифрагированного пучка , а не сам дифрагированный пучок. Таким образом, можно получить гораздо более высокое разрешение напряженных областей вокруг дефектов.
Кольцевая темная визуализация требует формирования изображений с электронами, дифрагированными в кольцевую апертуру, центрированную на нерассеянном луче, но не включающую его. Для больших углов рассеяния в сканирующем просвечивающем электронном микроскопе это иногда называют Z -контрастной визуализацией из-за усиленного рассеяния от атомов с высоким атомным числом.
Это математический метод, промежуточный между прямым и обратным (преобразование Фурье) пространством для исследования изображений с четко определенными периодичностями, например, изображений решетчатых полос электронного микроскопа. Как и в случае с аналоговой темнопольной визуализацией в просвечивающем электронном микроскопе, он позволяет «подсвечивать» те объекты в поле зрения, где находятся интересующие периодичности. В отличие от аналоговой темнопольной визуализации он также может позволить отображать Фурье-фазу периодичностей и, следовательно, фазовые градиенты, которые предоставляют количественную информацию о векторной деформации решетки.
