stringtranslate.com

Термолизин

Термолизин ( EC 3.4.24.27, нейтральная протеиназа Bacillus thermoproteolyticus , термоаза , термоаза Y10 , TLN ) — термостабильный нейтральный фермент металлопротеиназа, вырабатываемый грамположительными бактериями Bacillus thermoproteolyticus . [2] Для активности фермента ему требуется один ион цинка и четыре иона кальция для структурной стабильности. [3] Термолизин специфически катализирует гидролиз пептидных связей , содержащих гидрофобные аминокислоты . Однако термолизин также широко используется для образования пептидных связей посредством обратной реакции гидролиза. [4] Термолизин — наиболее стабильный член семейства металлопротеиназ, вырабатываемых различными видами Bacillus . Эти ферменты также называются «нейтральными» протеиназами или термолизин-подобными протеиназами (TLP).

Синтез

Как и все бактериальные внеклеточные протеазы, термолизин сначала синтезируется бактерией как препрофермент . [5] Термолизин синтезируется как препрофермент, состоящий из сигнального пептида длиной 28 аминокислот, пропептида длиной 204 аминокислоты и самого зрелого фермента длиной 316 аминокислот. Сигнальный пептид действует как сигнал для транслокации препротермолизина в бактериальную цитоплазматическую мембрану . Затем в периплазме препротермолизин преобразуется в протермолизин сигнальной пептидазой . Затем пропоследовательность действует как молекулярный шаперон и приводит к саморасщеплению пептидной связи, связывающей про- и зрелую последовательности. Затем зрелый белок секретируется во внеклеточную среду. [6]

Структура

Термолизин имеет молекулярную массу 34 600 Да. Его общая структура состоит из двух приблизительно сферических доменов с глубокой щелью, проходящей через середину молекулы, разделяющей два домена. Вторичная структура каждого домена довольно сильно отличается, N-концевой домен состоит в основном из бета-складчатого листа , в то время как C-концевой домен в основном имеет альфа-спиральную структуру. Эти два домена соединены центральной альфа-спиралью, охватывающей аминокислоты 137–151. [7]

В отличие от многих белков, которые претерпевают конформационные изменения при нагревании и денатурации , термолизин не претерпевает никаких серьезных конформационных изменений до температуры не менее 70 °C. [8] Термическая стабильность членов семейства TLP измеряется в терминах температуры T 50. При этой температуре инкубация в течение 30 минут снижает активность ферментов вдвое. Термолизин имеет значение T 50 86,9 °C, что делает его самым термостабильным членом семейства TLP. [9] Исследования вклада кальция в стабильность термолизина показали, что при термической инактивации из молекулы высвобождается один ион кальция. [10] Предотвращение этого кальция от первоначального связывания с молекулой путем мутации его сайта связывания снизило стабильность термолизина на 7 °C. Однако, хотя связывание кальция вносит значительный вклад в стабилизацию термолизина, более важным для стабильности является небольшой кластер аминокислот N-концевого домена, расположенный на поверхности белка. [9] В частности, фенилаланин (F) в аминокислотной позиции 63 и пролин (P) в аминокислотной позиции 69 вносят значительный вклад в стабильность термолизина. Изменение этих аминокислот на треонин (T) и аланин (A) соответственно в менее стабильной термолизин-подобной протеиназе, производимой Bacillus stearothermophillus (TLP-ste), приводит к индивидуальному снижению стабильности на 7 °C (F63→T) и 6,3 °C (P69→A), а в сочетании к снижению стабильности на 12,3 °C. [9]

Приложения

Ссылки

  1. ^ PDB : 3TMN ​; Holden HM, Matthews BW (март 1988). «Связывание L-валил-L-триптофана с кристаллическим термолизином иллюстрирует способ взаимодействия продукта гидролиза пептида». J. Biol. Chem . 263 (7): 3256–60. doi :10.2210/pdb3tmn/pdb. PMID  3343246.
  2. ^ Эндо, С. (1962). «Исследования протеазы, продуцируемой термофильными бактериями». J. Ferment. Technol . 40 : 346–353.
  3. ^ Tajima M, Urabe I и др. (1976). «Роль ионов кальция в термостабильности термолизина и нейтральной протеазы Bacillus subtilis var. amylosacchariticus». Eur. J. Biochem . 64 (1): 243–247. doi : 10.1111/j.1432-1033.1976.tb10293.x . PMID  819262.
  4. ^ Trusek-Holownia A. (2003). «Синтез ZAlaPheOMe, предшественника горького дипептида в двухфазной системе этилацетат-вода, катализируемой термолизином». J. Biotechnol . 102 (2): 153–163. doi :10.1016/S0168-1656(03)00024-5. PMID  12697393.
  5. ^ Ясукава К, Кусано М, Иноуе К (2007). «Новый метод внеклеточного производства рекомбинантного термолизина путем совместной экспрессии зрелой последовательности и пропоследовательности в Escherichia coli». Protein Eng. Des. Sel . 20 (8): 375–383. doi : 10.1093/protein/gzm031 . PMID  17616558.
  6. ^ Inouye K, Kusano M, et al. (2007). Инженерия, экспрессия, очистка и производство рекомбинантного термолизина . Biotechnology Annual Review. Vol. 13. pp. 43–64. doi :10.1016/S1387-2656(07)13003-9. ISBN 978-0-444-53032-5. PMID  17875473. {{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )
  7. ^ Holmes MA, Matthews BW (1982). «Структура термолизина, уточненная при разрешении 1,6 А». J. Mol. Biol . 160 (4): 623–639. doi :10.1016/0022-2836(82)90319-9. PMID  7175940.
  8. ^ Matthews BW, Weaver LH, Kester WR (1974). «Конформация термолизина». J. Biol. Chem . 249 (24): 8030–8044. doi : 10.1016/S0021-9258(19)42067-X . PMID  4214815.
  9. ^ abc Eijsink VG, Veltman OR, et al. (1995). "Структурные детерминанты стабильности термолизин-подобных протеиназ". Nat. Struct. Biol . 2 (5): 374–379. doi :10.1038/nsb0595-374. PMID  7664094. S2CID  37785818.
  10. ^ Dahlquist FW, Long JW, Bigbee WL (1976). «Роль кальция в термической стабильности термолизина». Биохимия . 15 (5): 1103–1111. doi :10.1021/bi00650a024. PMID  814920.
  11. ^ Ягасаки, Макото; Хашимото, Син-ичи (ноябрь 2008 г.). «Синтез и применение дипептидов; современное состояние и перспективы». Прикладная микробиология и биотехнология . 81 (1): 13–22. doi :10.1007/s00253-008-1590-3. PMID  18795289. S2CID  10200090.
  12. ^ Minde, David P.; Maurice, Madelon M.; Rüdiger, Stefan GD (2012). «Определение биофизической стабильности белка в лизатах с помощью быстрого протеолизного анализа, FASTpp». PLOS ONE . 7 (10): e46147. Bibcode : 2012PLoSO...746147M. doi : 10.1371/journal.pone.0046147 . PMC 3463568. PMID  23056252 . 

Внешние ссылки