stringtranslate.com

трипсин

Трипсин — это фермент в первом отделе тонкого кишечника, который начинает переваривание белковых молекул, разрезая длинные цепи аминокислот на более мелкие части. Это сериновая протеаза из суперсемейства клана PA , обнаруженная в пищеварительной системе многих позвоночных , где она гидролизует белки . [2] [3] Трипсин образуется в тонком кишечнике , когда активируется его проферментная форма, трипсиноген , вырабатываемый поджелудочной железой . Трипсин разрезает пептидные цепи в основном на карбоксильной стороне аминокислот лизина или аргинина . Он используется для многочисленных биотехнологических процессов. Этот процесс обычно называют протеолизом или трипсинизацией трипсиногена , и белки, которые были переварены/обработаны трипсином, называются трипсинизированными. [4]

Трипсин был открыт в 1876 году Вильгельмом Кюне . [5] Хотя многие источники утверждают, что Кюне назвал трипсин от древнегреческого слова «tripsis», означающего «тереть», поскольку фермент был впервые выделен путем растирания поджелудочной железы стеклянным порошком и спиртом, на самом деле Кюне назвал трипсин от древнегреческого слова «thrýpto», что означает «я ломаю» или «я распадаюсь на части». [6]

Функция

В двенадцатиперстной кишке трипсин катализирует гидролиз пептидных связей , расщепляя белки на более мелкие пептиды. Затем пептидные продукты подвергаются дальнейшему гидролизу в аминокислоты с помощью других протеаз, что делает их доступными для всасывания в кровоток. Триптическое переваривание является необходимым этапом всасывания белка, поскольку белки, как правило, слишком велики, чтобы всасываться через слизистую оболочку тонкого кишечника . [7]

Трипсин вырабатывается как неактивный зимоген трипсиноген в поджелудочной железе. Когда поджелудочная железа стимулируется холецистокинином , он затем секретируется в первую часть тонкого кишечника ( двенадцатиперстную кишку ) через проток поджелудочной железы . Попав в тонкий кишечник, фермент энтерокиназа (также называемый энтеропептидазой) активирует трипсиноген в трипсин путем протеолитического расщепления . Затем трипсин активирует дополнительный трипсин, химотрипсин и карбоксипептидазу .

Механизм

Ферментативный механизм аналогичен механизму других сериновых протеаз. Эти ферменты содержат каталитическую триаду , состоящую из гистидина -57, аспартата -102 и серина -195. [8] Эта каталитическая триада ранее называлась системой передачи заряда, подразумевающей отвод протонов от серина к гистидину и от гистидина к аспартату, но из-за доказательств, предоставленных ЯМР, что полученная алкоксидная форма серина будет иметь гораздо более сильное притяжение к протону, чем имидазольное кольцо гистидина, современное мнение вместо этого предполагает, что серин и гистидин каждый имеют фактически равную долю протона, образуя с ними короткие низкобарьерные водородные связи . [9] [ нужна страница ] Таким образом, нуклеофильность активного центра серина увеличивается, что облегчает его атаку на амидный углерод во время протеолиза. Ферментативная реакция, катализируемая трипсином, термодинамически выгодна, но требует значительной энергии активации (она « кинетически невыгодна»). Кроме того, трипсин содержит «оксианионную дырку», образованную атомами водорода амидной цепи Gly-193 и Ser-195, которые посредством водородных связей стабилизируют отрицательный заряд, который накапливается на кислороде амида после нуклеофильной атаки на плоский амидный углерод кислородом серина, заставляя этот углерод принимать тетраэдрическую геометрию. Такая стабилизация этого тетраэдрического промежуточного соединения помогает снизить энергетический барьер его образования и сопровождается снижением свободной энергии переходного состояния. Предпочтительное связывание переходного состояния является ключевой особенностью химии ферментов.

Отрицательный остаток аспартата (Asp 189), расположенный в каталитическом кармане (S1) трипсина, отвечает за привлечение и стабилизацию положительно заряженного лизина и/или аргинина и, таким образом, отвечает за специфичность фермента. Это означает, что трипсин преимущественно расщепляет белки на карбоксильной стороне (или « C-концевой стороне») аминокислот лизина и аргинина, за исключением случаев, когда любой из них связан с C-концевым пролином , [10] хотя данные крупномасштабной масс-спектрометрии предполагают, что расщепление происходит даже с пролином. [11] Трипсин считается эндопептидазой , т. е. расщепление происходит внутри полипептидной цепи, а не на концевых аминокислотах, расположенных на концах полипептидов .

Характеристики

Человеческий трипсин имеет оптимальную рабочую температуру около 37 °C. [12] Напротив, у атлантической трески есть несколько типов трипсинов для пойкилотермных рыб, чтобы выживать при разных температурах тела. Трипсины трески включают трипсин I с диапазоном активности от 4 до 65 °C (от 39 до 149 °F) и максимальной активностью при 55 °C (131 °F), а также трипсин Y с диапазоном от 2 до 30 °C (от 36 до 86 °F) и максимальной активностью при 21 °C (70 °F). [13]

Как белок, трипсин имеет различные молекулярные массы в зависимости от источника. Например, молекулярная масса 23,3 кДа сообщается для трипсина из бычьих и свиных источников.

Активность трипсина не зависит от ингибитора фермента тозилфенилаланилхлорметилкетона ( ТПХК) , который дезактивирует химотрипсин .

Трипсин следует хранить при очень низких температурах (от −20 до −80 °C), чтобы предотвратить автолиз , который также может быть затруднен хранением трипсина при pH 3 или использованием трипсина, модифицированного восстановительным метилированием. Когда pH снова доводится до pH 8, активность возвращается.

Изоферменты

Эти человеческие гены кодируют белки с ферментативной активностью трипсина:

Другие изоформы трипсина могут быть обнаружены и в других организмах.

Клиническое значение

Активация трипсина из протеолитического расщепления трипсиногена в поджелудочной железе может привести к серии событий, которые вызывают самопереваривание поджелудочной железы, что приводит к панкреатиту . Одним из последствий аутосомно-рецессивного заболевания кистозного фиброза является дефицит транспорта трипсина и других пищеварительных ферментов из поджелудочной железы. Это приводит к расстройству, называемому мекониевой непроходимостью кишечника , которое включает в себя кишечную непроходимость ( илеус ) из-за слишком густого мекония , который обычно расщепляется трипсином и другими протеазами, а затем выводится с калом. [14]

Приложения

Трипсин в большом количестве содержится в поджелудочной железе и может быть довольно легко очищен. Поэтому он широко используется в различных биотехнологических процессах.

В лаборатории тканевых культур трипсин используется для ресуспендирования клеток, прилипших к стенке чашки для культивирования клеток во время процесса сбора клеток. [15] Некоторые типы клеток прилипают к стенкам и дну чашки при культивировании in vitro . Трипсин используется для расщепления белков, удерживающих культивируемые клетки на чашке, чтобы клетки можно было удалить с пластин.

Трипсин также можно использовать для диссоциации препарированных клеток (например, перед фиксацией и сортировкой клеток).

Трипсин можно использовать для расщепления казеина в грудном молоке. Если трипсин добавить к раствору сухого молока, расщепление казеина сделает молоко полупрозрачным . Скорость реакции можно измерить, используя количество времени, необходимое для того, чтобы молоко стало полупрозрачным.

Трипсин обычно используется в биологических исследованиях во время экспериментов по протеомике для расщепления белков на пептиды для масс-спектрометрического анализа, например, расщепления в геле . Трипсин особенно подходит для этого, поскольку он имеет очень хорошо определенную специфичность, поскольку он гидролизует только пептидные связи, в которых карбонильная группа представлена ​​либо остатком аргинина, либо остатком лизина.

Трипсин в своей микробной форме также может использоваться для растворения тромбов и лечения воспалений в своей панкреатической форме.

В ветеринарии трипсин входит в состав спреев для обработки ран, таких как Дебрисол, для растворения омертвевших тканей и гноя в ранах у лошадей, крупного рогатого скота, собак и кошек. [16]

В еде

Коммерческие препараты протеазы обычно состоят из смеси различных ферментов протеазы, часто включающей трипсин. Эти препараты широко используются в пищевой промышленности: [17]

ингибитор трипсина

Чтобы предотвратить действие активного трипсина в поджелудочной железе, которое может быть очень разрушительным, ингибиторы, такие как BPTI и SPINK1 в поджелудочной железе и α1-антитрипсин в сыворотке, присутствуют как часть защиты от его ненадлежащей активации. Любой трипсин, преждевременно образованный из неактивного трипсиногена, затем связывается ингибитором. Взаимодействие белок-белок между трипсином и его ингибиторами является одним из самых прочных, и трипсин связывается некоторыми из его панкреатических ингибиторов почти необратимо. [18] В отличие от почти всех известных белковых сборок, некоторые комплексы трипсина, связанные его ингибиторами, нелегко диссоциируют после обработки 8М мочевиной. [19]

Ингибиторы трипсина могут служить инструментами при решении проблем, связанных с нарушениями обмена веществ и ожирением. Известно, что нарушения обмена веществ, ожирение и избыточный вес увеличивают распространенность неинфекционных хронических заболеваний. [20] Изучение различных способов смягчения этого явления, включая использование ингибиторов трипсина, представляет интерес для политики общественного здравоохранения. Эти ингибиторы обладают способностью снижать рак толстой кишки, молочной железы, кожи и простаты посредством радиопротекторной и антиканцерогенной активности. Ингибиторы трипсина могут действовать как регуляторные механизмы для контроля высвобождения нейтрофильных протеаз и предотвращения значительного повреждения тканей. [20] Что касается сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с непродуктивной активностью сериновой протеазы, ингибиторы трипсина могут блокировать их активность в агрегации тромбоцитов, фибринолизе, коагуляции и свертывании крови.

Многофункциональность ингибиторов трипсина включает в себя то, что они являются потенциальными ингибиторами протеазы для активности AMP. [21] Хотя механизмы антибактериального действия ингибиторов трипсина неясны, исследования были направлены на изучение их механизмов в качестве потенциальных приложений для лечения бактериальных инфекций. [21] Исследования и сканирующая микроскопия показали антибактериальное действие на бактериальные мембраны Staphylococcus aureus . [21] Ингибиторы трипсина из кожи амфибий показали стимуляцию бактериальной смерти, которая повлияла на клеточную стенку и мембрану Staphylococcus aureus . [21] Исследования также анализировали антибактериальное действие пептидов ингибиторов трипсина, белков и E. coli . Результаты показали достаточное предотвращение роста бактерий. Однако ингибиторы трипсина должны соответствовать определенным критериям, чтобы их можно было использовать в пищевых продуктах и ​​медицинских процедурах. [21]

Альтернативы трипсину

Переваривание трипсином внеклеточного матрикса является обычной практикой в ​​клеточной культуре. Однако эта ферментативная деградация клеток может негативно влиять на жизнеспособность клеток и поверхностные маркеры, особенно в стволовых клетках. Существуют более мягкие альтернативы, чем трипсин, такие как Accutase, которые не влияют на поверхностные маркеры, такие как cd14, cd117, cd49f, cd292. [22] [23] Однако Accutase снижает поверхностные уровни FasL и рецептора Fas на макрофагах , эти рецепторы связаны с цитотоксичностью клеток в иммунной системе и также могут способствовать гибели клеток, связанной с апоптозом . [24]

ПроАланаза также может служить альтернативой трипсину в протеомных приложениях. [25] ПроАланаза — это протеаза грибка Aspergillus niger , которая может достигать высокой протеолитической активности и специфичности для пищеварения при правильных условиях. [25] ПроАланаза, кислая пролил-эндопептидазная протеаза, ранее изученная как An-PEP, наблюдалась в различных экспериментах для определения ее специфичности. [25] ПроАланаза оптимально работала в приложениях ЖХ-МС с коротким временем пищеварения и очень кислым pH. [25]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ PDB : 1UTN ​; Leiros HK, Brandsdal BO, Andersen OA, Os V, Leiros I, Helland R и др. (апрель 2004 г.). «Специфичность трипсина, выявленная с помощью расчетов LIE, рентгеновских структур и измерений констант ассоциации». Protein Science . 13 (4): 1056–70. doi : 10.1110/ps.03498604 . PMC  2280040 . PMID  15044735.
  2. ^ Rawlings ND, Barrett AJ (1994). "[2] Семейства сериновых пептидаз" . Семейства сериновых пептидаз . Методы в энзимологии. Т. 244. С. 19–61. doi :10.1016/0076-6879(94)44004-2. ISBN 978-0-12-182145-6. PMC  7133253 . PMID  7845208.
  3. ^ Немецкий физиолог Вильгельм Кюне (1837-1900) открыл трипсин в 1876 году. См.: Kühne W (1877). «Über das Trypsin (Энзим Панкреаса)». Verhandlungen des Naturhistorisch-medicinischen Vereins zu Heidelberg . новая серия. 1 (3): 194–198 - через Google Книги.Значок открытого доступа
  4. ^ Engelking LR (2015-01-01). "Глава 7 - Переваривание белков". Учебник ветеринарной физиологической химии (третье изд.). Boston: Academic Press. стр. 39–44. doi :10.1016/B978-0-12-391909-0.50007-4. ISBN 978-0-12-391909-0.
  5. ^ Кюне В. (6 марта 1876 г.). «Ueber das Trypsin (Enzym des Pankreas)» [О трипсине (ферменте поджелудочной железы)]. В Naturhistorisch-medizinischen Verein (ред.). Verhandlungen des Naturhistorisch-medizinischen Vereins zu Heidelberg [ Переговоры Медицинской ассоциации естественной истории в Гейдельберге ] (на немецком языке). Гейдельберг, Германия: Universitätsbuchhandlung Карла Винтера (опубликовано в 1877 г.). стр. 194–8 - через Archive.org.
  6. ^ Джиролами ГС (2024). «Происхождение и вероятная этимология слова «трипсин»". Bull. Hist. Chem . 49 (1): 59–60.
  7. ^ "Пищеварение белков". Элективный курс (Клиническая биохимия) . Тернопольский национальный медицинский университет. 14 июля 2015 г. Архивировано из оригинала 8 августа 2020 г. Получено 11 апреля 2020 г.
  8. ^ Полгар Л. (октябрь 2005 г.). «Каталитическая триада сериновых пептидаз». Cellular and Molecular Life Sciences . 62 (19–20): 2161–72. doi :10.1007/s00018-005-5160-x. PMC 11139141 . PMID  16003488. S2CID  3343824. 
  9. ^ Voet D, Voet JG (2011). Биохимия (4-е изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons. ISBN 978-0-470-57095-1. OCLC  690489261.
  10. ^ "Sequencing Grade Modified Trypsin" (PDF) . promega.com. 2007-04-01. Архивировано из оригинала (PDF) 2003-05-19 . Получено 2009-02-08 .
  11. ^ Rodriguez J, Gupta N, Smith RD, Pevzner PA (январь 2008 г.). "Does trypsin cut before proline?" (PDF) . Journal of Proteome Research . 7 (1): 300–5. CiteSeerX 10.1.1.163.4052 . doi :10.1021/pr0705035. PMID  18067249. Архивировано из оригинала (PDF) 2020-08-13 . Получено 2017-10-25 . 
  12. ^ Chelulei Cheison S, Brand J, Leeb E, Kulozik U (март 2011 г.). «Анализ влияния изменений температуры в сочетании с различным щелочным pH на схему гидролиза β-лактоглобулина трипсином с использованием MALDI-TOF-MS/MS». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии . 59 (5): 1572–81. doi :10.1021/jf1039876. PMID  21319805.
  13. ^ Гудмундсдоттир А., Палсдоттир Х.М. (2005). «Трипсины атлантической трески: от фундаментальных исследований до практических приложений». Морская биотехнология . 7 (2): 77–88. Bibcode : 2005MarBt...7...77G. doi : 10.1007/s10126-004-0061-9. PMID  15759084. S2CID  42480996.
  14. ^ Noone PG, Zhou Z, Silverman LM, Jowell PS, Knowles MR, Cohn JA (декабрь 2001 г.). «Мутации генов муковисцидоза и риск панкреатита: связь с переносом эпителиальных ионов и мутациями генов ингибиторов трипсина». Гастроэнтерология . 121 (6): 1310–9. doi : 10.1053/gast.2001.29673 . PMID  11729110.
  15. ^ "Трипсин-ЭДТА (0,25%)". Stem Cell Technologies . Получено 2012-02-23 .
  16. ^ "Дебрисол". drugs.com.
  17. ^ "Protease - GMO Database". GMO Compass . Европейский Союз. 2010-07-10. Архивировано из оригинала 2015-02-24 . Получено 2012-01-01 .
  18. ^ Voet D, Voet JG (1995). Биохимия (2-е изд.). Джон Уайли и сыновья. стр. 396–400. ISBN 978-0-471-58651-7.
  19. ^ Levilliers N, Péron M, Arrio B, Pudles J (октябрь 1970 г.). «О механизме действия протеолитических ингибиторов. IV. Влияние 8 М мочевины на стабильность трипсина в комплексах трипсин-ингибитор». Архивы биохимии и биофизики . 140 (2): 474–83. doi :10.1016/0003-9861(70)90091-3. PMID  5528741.
  20. ^ ab Кристина Оливейра де Лима V, Пиувезам Дж, Леал Лима Масиэль Б, Хелонеида де Араужо Мораиш А (декабрь 2019 г.). «Ингибиторы трипсина: многообещающие кандидаты в сытные белки в качестве дополнительного лечения ожирения и метаболических нарушений?». Журнал ингибирования ферментов и медицинской химии . 34 (1): 405–419. дои : 10.1080/14756366.2018.1542387. ПМК 6327991 . ПМИД  30734596. 
  21. ^ abcde de Souza Nascimento AM, de Oliveira Segundo VH, Фелипе Камело Агиар AJ, Пьювезам G, Соуза Пассос Т, Флорентино да Силва Чавес Дамасцено KS и др. (декабрь 2022 г.). «Механизмы антибактериального действия и механизм действия ингибиторов трипсина: систематический обзор». Журнал ингибирования ферментов и медицинской химии . 37 (1): 749–759. дои : 10.1080/14756366.2022.2039918. ПМЦ 8856033 . ПМИД  35168466. 
  22. ^ Quan Y, Yan Y, Wang X, Fu Q, Wang W, Wu J и др. (2012). «Влияние диссоциации клеток на идентификацию стволовых клеток рака груди». Cancer Biomarkers . 12 (3): 125–33. doi :10.3233/CBM-130300. PMID  23481571.
  23. ^ Skog M, Sivlér P, Steinvall I, Aili D, Sjöberg F, Elmasry M (май 2019). «Влияние ферментативного переваривания на культивируемые эпителиальные аутотрансплантаты». Cell Transplantation . 28 (5): 638–644. doi :10.1177/0963689719833305. PMC 7103596. PMID  30983404 . 
  24. ^ Lai TY, Cao J, Ou-Yang P, Tsai CY, Lin CW, Chen CC и др. (апрель 2022 г.). «Различные методы отсоединения адгезивных клеток и их влияние на экспрессию рецептора Fas и лиганда Fas на клеточной поверхности». Scientific Reports . 12 (1): 5713. Bibcode :2022NatSR..12.5713L. doi :10.1038/s41598-022-09605-y. PMC 8983651 . PMID  35383242. 
  25. ^ abcd Samodova D, Hosfield CM, Cramer CN, Giuli MV, Cappellini E, Franciosa G и др. (декабрь 2020 г.). «ProAlanase is an Effective Alternative to Trypsin for Proteomics Applications and Disulfide Bond Mapping». Молекулярная и клеточная протеомика . 19 (12): 2139–2157. doi : 10.1074/mcp.tir120.002129 . PMC 7710147. PMID  33020190. 

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки