Фаза S ( фаза синтеза ) — это фаза клеточного цикла , в которой происходит репликация ДНК , происходящая между фазами G1 и G2 . [1] Поскольку точное копирование генома имеет решающее значение для успешного деления клетки, процессы, происходящие во время фазы S , строго регулируются и широко сохраняются.
Вход в S-фазу контролируется точкой рестрикции G1 (R), которая обязывает клетки к оставшейся части клеточного цикла при наличии достаточного количества питательных веществ и сигналов роста. [2] Этот переход по сути необратим; после прохождения точки рестрикции клетка будет проходить через S-фазу, даже если условия окружающей среды станут неблагоприятными. [2]
Соответственно, вступление в S-фазу контролируется молекулярными путями, которые способствуют быстрому однонаправленному сдвигу в состоянии клетки. Например, у дрожжей рост клеток вызывает накопление циклина Cln3 , который образует комплекс с циклин-зависимой киназой CDK2. [3] Комплекс Cln3-CDK2 стимулирует транскрипцию генов S-фазы путем инактивации транскрипционного репрессора Whi5 . [3] Поскольку повышение регуляции генов S-фазы приводит к дальнейшему подавлению Whi5 , этот путь создает положительную обратную связь, которая полностью обязывает клетки к экспрессии генов S-фазы. [3]
Удивительно похожая схема регуляции существует в клетках млекопитающих. [3] Митогенные сигналы, полученные в течение фазы G1, вызывают постепенное накопление циклина D, который образует комплексы с CDK4/6. [3] Активный комплекс циклин D-CDK4/6 вызывает высвобождение фактора транскрипции E2F , который, в свою очередь, инициирует экспрессию генов S-фазы. [3] Несколько целевых генов E2F способствуют дальнейшему высвобождению E2F, создавая положительную обратную связь, подобную той, что обнаружена у дрожжей. [3]
На протяжении фазы M и фазы G1 клетки собирают неактивные пререпликационные комплексы (пре-RC) в точках начала репликации, распределенных по всему геному. [4] Во время S-фазы клетка преобразует пре-RC в активные репликационные вилки для инициации репликации ДНК. [4] Этот процесс зависит от активности киназы Cdc7 и различных CDK S-фазы, оба из которых активируются при входе в S-фазу. [4]
Активация пре-RC является строго регулируемым и высоко последовательным процессом. После того, как Cdc7 и S-фазные CDK фосфорилируют свои соответствующие субстраты, второй набор репликативных факторов связывается с пре-RC. [4] Стабильная ассоциация побуждает MCM-хеликазу раскручивать небольшой участок родительской ДНК на две нити одноцепочечной ДНК, которая, в свою очередь, рекрутирует репликационный белок A ( RPA ), связывающий одноцепочечный ДНК белок. [4] Рекрутирование RPA подготавливает репликационную вилку к загрузке репликативных ДНК- полимераз и скользящих зажимов PCNA . [4] Загрузка этих факторов завершает активную репликационную вилку и инициирует синтез новой ДНК.
Полная сборка репликационной вилки и активация происходит только на небольшом подмножестве точек начала репликации. Все эукариоты обладают гораздо большим количеством точек начала репликации, чем строго необходимо в течение одного цикла репликации ДНК. [5] Избыточные точки начала могут повышать гибкость репликации ДНК, позволяя клеткам контролировать скорость синтеза ДНК и реагировать на стресс репликации. [5]
Поскольку новая ДНК должна быть упакована в нуклеосомы для правильного функционирования, синтез канонических (невариантных) гистоновых белков происходит вместе с репликацией ДНК. Во время ранней S-фазы комплекс циклин E-Cdk2 фосфорилирует NPAT , ядерный коактиватор транскрипции гистонов. [6] NPAT активируется фосфорилированием и привлекает комплекс ремоделирования хроматина Tip60 к промоторам генов гистонов. [6] Активность Tip60 удаляет ингибирующие структуры хроматина и приводит к трех-десятикратному увеличению скорости транскрипции. [1] [6]
Помимо увеличения транскрипции генов гистонов, вступление в S-фазу также регулирует продукцию гистонов на уровне РНК. Вместо полиаденилированных хвостов канонические транскрипты гистонов обладают консервативным мотивом 3` stem loop , который селективно связывается с белком связывания Stem Loop Binding Protein ( SLBP ). [7] Связывание SLBP необходимо для эффективной обработки, экспорта и трансляции мРНК гистонов, что позволяет ему функционировать как высокочувствительный биохимический «переключатель». [7] Во время S-фазы накопление SLBP действует совместно с NPAT, радикально увеличивая эффективность продукции гистонов. [7] Однако после окончания S-фазы и SLBP, и связанная РНК быстро деградируют. [8] Это немедленно останавливает продукцию гистонов и предотвращает токсичное накопление свободных гистонов. [9]
Свободные гистоны, продуцируемые клеткой во время S-фазы, быстро включаются в новые нуклеосомы. Этот процесс тесно связан с репликационной вилкой, происходящей непосредственно «впереди» и «позади» репликационного комплекса. Транслокация MCM-хеликазы вдоль ведущей цепи разрушает родительские нуклеосомные октамеры, что приводит к высвобождению субъединиц H3-H4 и H2A-H2B. [10] Повторная сборка нуклеосом за репликационной вилкой опосредуется факторами сборки хроматина (CAF), которые слабо связаны с белками репликации. [4] [11] Хотя это не полностью изучено, повторная сборка, по-видимому, не использует полуконсервативную схему, наблюдаемую при репликации ДНК. [11] Эксперименты по маркировке показывают, что дупликация нуклеосом преимущественно консервативна. [11] [10] Отцовская нуклеосома ядра H3-H4 остается полностью отделенной от вновь синтезированного H3-H4, что приводит к образованию нуклеосом, которые содержат либо исключительно старый H3-H4, либо исключительно новый H3-H4. [10] [11] «Старые» и «новые» гистоны назначаются каждой дочерней нити полуслучайным образом, что приводит к равному распределению регуляторных модификаций. [10]
Сразу после деления каждая дочерняя хроматида обладает только половиной эпигенетических модификаций, присутствующих в отцовской хроматиде. [10] Клетка должна использовать этот частичный набор инструкций для восстановления функциональных доменов хроматина перед вступлением в митоз.
Для больших геномных регионов наследование старых нуклеосом H3-H4 достаточно для точного восстановления доменов хроматина. [10] Поликомбный репрессивный комплекс 2 ( PRC2 ) и несколько других комплексов, модифицирующих гистоны, могут «копировать» модификации, присутствующие на старых гистонах, на новые гистоны. [10] Этот процесс усиливает эпигенетические метки и противодействует разбавляющему эффекту дупликации нуклеосом. [10]
Однако для небольших доменов, приближающихся по размеру к отдельным генам, старые нуклеосомы распределены слишком тонко для точного распространения модификаций гистонов. [10] В этих регионах структура хроматина, вероятно, контролируется включением вариантов гистонов во время повторной сборки нуклеосом. [10] Тесная корреляция, наблюдаемая между H3.3/H2A.Z и транскрипционно активными регионами, подтверждает этот предложенный механизм. [10] К сожалению, причинно-следственная связь пока не доказана. [10]
Во время S-фазы клетка непрерывно проверяет свой геном на наличие аномалий. Обнаружение повреждения ДНК вызывает активацию трех канонических «контрольных точек» S-фазы, которые задерживают или останавливают дальнейшее развитие клеточного цикла: [12]
В дополнение к этим каноническим контрольным точкам, недавние данные свидетельствуют о том, что аномалии в поставке гистонов и сборке нуклеосом также могут изменять прогрессию S-фазы. [14] Истощение свободных гистонов в клетках Drosophila значительно продлевает S-фазу и вызывает постоянную остановку в G2-фазе. [14] Этот уникальный фенотип остановки не связан с активацией канонических путей повреждения ДНК, что указывает на то, что сборка нуклеосом и поставка гистонов могут быть тщательно изучены с помощью новой контрольной точки S-фазы. [14]