Ферменты ТЕТ представляют собой семейство метилцитозиндиоксигеназ десяти-одиннадцати транслокаций (ТЕТ) . Они играют важную роль в деметилировании ДНК . 5-Метилцитозин (см. первый рисунок) представляет собой метилированную форму цитозина основания ДНК (C), который часто регулирует транскрипцию генов и выполняет ряд других функций в геноме. [1]
Деметилирование ферментами ТЕТ (см. второй рисунок) может изменить регуляцию транскрипции. Ферменты ТЕТ катализируют гидроксилирование ДНК 5-метилцитозина (5mC) до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) и могут дополнительно катализировать окисление 5hmC до 5-формилцитозина (5fC), а затем до 5-карбоксицитозина (5caC). [2] 5fC и 5caC могут быть удалены из последовательности оснований ДНК путем эксцизионной репарации оснований и заменены цитозином в последовательности оснований.
Ферменты ТЕТ играют центральную роль в деметилировании ДНК , необходимом во время эмбриогенеза, гаметогенеза, памяти, обучения , привыкания и восприятия боли . [3]
Три родственных гена TET , TET1 , TET2 и TET3, кодируют соответственно три родственных белка млекопитающих TET1, TET2 и TET3. Все три белка обладают 5mC-оксидазной активностью, но различаются архитектурой домена. [4] Белки ТЕТ представляют собой крупные (~ 180–230 кДа) мультидоменные ферменты. Все белки ТЕТ содержат консервативный домен двухцепочечной β-спирали (DSBH), богатый цистеином домен и сайты связывания кофакторов Fe (II) и 2-оксоглутарата (2-OG), которые вместе образуют центральную каталитическую область в С -конец . В дополнение к каталитическому домену полноразмерные белки TET1 и TET3 имеют N-концевой домен цинкового пальца CXXC , который может связывать ДНК. [5] В белке TET2 отсутствует домен CXXC, но ген IDAX , сосед гена TET2, кодирует белок CXXC4. Считается, что IDAX играет роль в регуляции активности TET2, способствуя его рекрутированию в неметилированные CpG.
Три гена ТЕТ экспрессируются в виде разных изоформ , включая по меньшей мере две изоформы ТЕТ1, три ТЕТ2 и три изоформы ТЕТ3. [2] [6] Различные изоформы генов ТЕТ экспрессируются в разных клетках и тканях. Полноразмерная каноническая изоформа TET1, по-видимому, практически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и первичными зародышевыми клетками (PGC). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере, у мышей, возникает в результате использования альтернативного промотора, который приводит к образованию короткого транскрипта и укороченного белка, называемого TET1. Три изоформы ТЕТ2 возникают из разных промоторов. Они экспрессируются и активны в эмбриогенезе и дифференцировке гемопоэтических клеток . Изоформами TET3 являются полноразмерная форма TET3FL, короткая форма сплайсинга TET3 и форма, которая встречается в ооцитах, обозначенная TET3o. TET3o создается путем использования альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o встречается только в ооцитах и на одноклеточной стадии зиготы и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в любом другом типе клеток или протестированной ткани взрослой мыши. В то время как экспрессия TET1 едва может быть обнаружена в ооцитах и зиготах, а TET2 экспрессируется лишь умеренно, вариант TET3 TET3o показывает чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но почти отсутствует на 2-клеточной стадии. Похоже, что TET3o, которого много в ооцитах и зиготах на одноклеточной стадии, является основным ферментом TET, используемым, когда в отцовском геноме происходит почти 100% быстрое деметилирование сразу после оплодотворения и до начала репликации ДНК (см. Деметилирование ДНК ).
Многие различные белки связываются с определенными ферментами ТЕТ и рекрутируют ТЕТ в определенные места генома. В некоторых исследованиях необходим дальнейший анализ, чтобы определить, опосредует ли взаимодействие само по себе рекрутирование или вместо этого взаимодействующий партнер помогает установить благоприятную среду хроматина для связывания TET. Клетки, обедненные TET1 и TET2, выявили различные целевые предпочтения этих двух ферментов с TET1-предпочтительными промоторами и TET2-предпочтительными телами генов с высокой экспрессией генов и энхансеров. [7]
Три ДНК-метилтрансферазы млекопитающих ( DNMT ) отдают предпочтение добавлению метильной группы к 5-му атому углерода цитозина, где за цитозиновым нуклеотидом следует гуаниновый нуклеотид в линейной последовательности оснований вдоль его направления 5' → 3' (в CpG-сайты ). [8] Это формирует сайт 5mCpG. Более 98% метилирования ДНК происходит в сайтах CpG в соматических клетках млекопитающих . [9] Таким образом, ферменты ТЕТ в основном инициируют деметилирование на сайтах 5mCpG.
Оксогуанингликозилаза (OGG1) является одним из примеров белка, который рекрутирует фермент ТЕТ. TET1 способен действовать на 5mCpG, если АФК сначала воздействовали на гуанин с образованием 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG или его таутомер 8-oxo-dG), в результате чего образуется динуклеотид 5mCp-8-OHdG ( см. рисунок). [10] После образования 5mCp-8-OHdG базовый фермент эксцизионной репарации OGG1 связывается с повреждением 8-OHdG без немедленного удаления (см. Рисунок). Присоединение OGG1 к сайту 5mCp-8-OHdG рекрутирует TET1 , позволяя TET1 окислять 5mC, соседний с 8-OHdG. Это запускает путь деметилирования.
EGR1 — еще один пример белка, который рекрутирует фермент TET. [11] EGR1 играет важную роль в обучении и памяти. [12] [13] Когда новое событие, такое как обусловленность страхом , вызывает формирование памяти, информационная РНК EGR1 быстро и избирательно активируется в подмножествах нейронов в определенных областях мозга, связанных с обучением и формированием памяти. [14] TET1s является преобладающей изоформой TET1, которая экспрессируется в нейронах. [15] Когда белки EGR1 экспрессируются, они, по-видимому, доставляют TET1 примерно в 600 сайтов в геноме нейрона. [11] Затем EGR1 и TET1, по-видимому, взаимодействуют в деметилировании и тем самым активации экспрессии генов, расположенных ниже сайтов связывания EGR1 в ДНК. [11]
Процессивность ТЕТ можно рассматривать на трех уровнях: физическом, химическом и генетическом. Физическая процессивность означает способность белка ТЕТ скользить по ДНК от одного сайта CpG к другому. Исследование in vitro показало, что связанный с ДНК ТЕТ не окисляет преимущественно другие сайты CpG на той же молекуле ДНК, что указывает на то, что ТЕТ не является физически процессивным. Химическая технологичность относится к способности ТЕТ итеративно катализировать окисление 5mC до 5caC без высвобождения его субстрата. Похоже, что ТЕТ может действовать как посредством химически процессивных, так и непроцессивных механизмов в зависимости от условий реакции. Генетическая процессивность относится к генетическому результату ТЕТ-опосредованного окисления в геноме, как показано картированием окисленных оснований. В эмбриональных стволовых клетках мыши многие геномные области или сайты CpG модифицируются так, что 5mC заменяется на 5hmC, но не на 5fC или 5caC, тогда как во многих других сайтах CpG 5mC модифицируются до 5fC или 5caC, но не 5hmC, что позволяет предположить, что 5mC процессируется в разные состояния в разных регионах генома или сайтах CpG. [7]
Ферменты ТЕТ представляют собой диоксигеназы из семейства альфа-кетоглутарат-зависимых гидроксилаз . Фермент ТЕТ представляет собой альфа-кетоглутарат (α-KG)-зависимую диоксигеназу, которая катализирует реакцию окисления путем включения одного атома кислорода из молекулярного кислорода (O 2 ) в его субстрат, 5-метилцитозин в ДНК (5mC), с образованием продукта. 5-гидроксиметилцитозин в ДНК. Это преобразование сопровождается окислением ко-субстрата α-KG до сукцината и диоксида углерода (см. Рисунок).
Первый этап включает связывание α-KG и 5-метилцитозина с активным центром фермента ТЕТ. Каждый из ферментов ТЕТ содержит основной каталитический домен с двухцепочечной укладкой β-спирали, которая содержит важные металлсвязывающие остатки, обнаруженные в семействе Fe(II)/α-KG-зависимых оксигеназ. [16] α-KG координируется как бидентатный лиганд (связанный в двух точках) с Fe(II) (см. рисунок), тогда как 5mC удерживается нековалентной силой в непосредственной близости. Активный центр ТЕТ содержит высококонсервативный триадный мотив, в котором каталитически важный Fe(II) удерживается двумя остатками гистидина и одним остатком аспарагиновой кислоты (см. Рисунок). Триада связывается с одной стороной Fe-центра, оставляя три лабильных сайта, доступных для связывания α-KG и O 2 (см. рисунок). Затем ТЕТ преобразует 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин, тогда как α-кетоглутарат превращается в сукцинат и CO 2 .
Белки ТЕТ также обладают активностью, независимой от деметилирования ДНК. [17] К ним относятся, например, взаимодействие TET2 с O -связанной N -ацетилглюкозамин ( O-GlcNAc ) трансферазой, способствующее ацилированию гистонов O-GlcN и влияющему на транскрипцию генов-мишеней. [18]
Геном спермы мыши на 80–90% метилирован по сайтам CpG в ДНК, что составляет около 20 миллионов метилированных сайтов. [19] После оплодотворения , в начале первого дня эмбриогенеза , отцовские хромосомы почти полностью деметилируются за шесть часов в результате активного ТЕТ-зависимого процесса, прежде чем начинается репликация ДНК (синяя линия на рисунке).
Деметилирование материнского генома происходит по другому процессу. В зрелом ооците около 40% его CpG-сайтов в ДНК метилированы. У эмбриона до имплантации вплоть до стадии бластоцисты (см. рисунок) единственной присутствующей метилтрансферазой является изоформа DNMT1 , обозначенная DNMT1o. [20] Похоже, что деметилирование материнских хромосом в основном происходит за счет блокировки входа метилирующего фермента DNMT1o в ядро, за исключением краткого периода на стадии 8 клеток (см. Деметилирование ДНК ). Таким образом, ДНК материнского происхождения подвергается пассивному деметилированию за счет разбавления метилированной материнской ДНК во время репликации (красная линия на рисунке). Морула (на стадии 16 клеток ) имеет лишь небольшое количество метилирования ДНК (черная линия на рисунке).
Вновь образованные первичные зародышевые клетки (PGC) в имплантированном эмбрионе деградируют из соматических клеток примерно на 7-й день эмбриогенеза у мышей. На этом этапе PGC имеют высокий уровень метилирования. Эти клетки мигрируют из эпибласта к гонадному гребню . Согласно обзору Messerschmidt et al., [21] большинство PGCs задерживаются в фазе G2 клеточного цикла, когда они мигрируют к задней кишке в течение эмбриональных дней с 7.5 по 8.5 . Затем деметилирование ПГК происходит в две волны. [21] Существует как пассивное, так и активное, ТЕТ-зависимое деметилирование первичных половых клеток. На 9,5 день первичные зародышевые клетки начинают быстро реплицироваться, начиная с примерно 200 ПЗК на 9,5 день эмбриона до примерно 10 000 ППК на 12,5 день. [22] В период с 9,5 по 12,5 дней DNMT3a и DNMT3b подавляются, а DNMT1 присутствует в ядре на высоком уровне. Но DNMT1 не способен метилировать цитозины в течение дней с 9,5 по 12,5, поскольку ген UHRF1 (также известный как NP95 ) репрессируется, а UHRF1 является важным белком, необходимым для привлечения DNMT1 в очаги репликации, где происходит поддерживающее метилирование ДНК. [22] Это пассивная форма деметилирования с разбавлением.
Кроме того, с 9,5 по 13,5 день эмбриона происходит активная форма деметилирования. Как показано на рисунке пути деметилирования выше, два фермента играют центральную роль в активном деметилировании. Это метилцитозиндиоксигеназа десять-одиннадцать транслокаций (ТЕТ) и тимин-ДНК-гликозилаза (ТДГ). Один конкретный фермент TET, TET1 и TDG, присутствуют на высоких уровнях с 9,5 по 13,5 дня эмбриона [22] и используются в активном TET-зависимом деметилировании во время гаметогенеза. [21] Геномы PGC демонстрируют самые низкие уровни метилирования ДНК среди всех клеток за весь жизненный цикл мыши к 13,5 эмбриональному дню. [23]
Обучение и память имеют уровни постоянства, в отличие от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые носят временный характер. Обучение и память могут накапливаться либо медленно (таблица умножения), либо быстро (прикосновение к горячей плите), но однажды достигнутые, их можно использовать в сознательном использовании в течение длительного времени. Крысы, подвергшиеся одному случаю контекстуального формирования страха, создают особенно сильную долговременную память. Через 24 часа после обучения было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа крысы дифференциально метилированы . Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после тренировки, причем более 500 генов были деметилированы. [24] Результаты, аналогичные результатам, полученным в гиппокампе крысы, были также получены у мышей с контекстуальным обусловливанием страха. [25]
В гиппокампе мозга сначала сохраняются контекстуальные воспоминания о страхе (см. рисунок), но это хранилище является временным и не остается в гиппокампе. У крыс контекстуальный страх исчезает, когда гиппокампэктомия подвергается гиппокампэктомии всего через день после кондиционирования, но у крыс сохраняется значительная часть контекстуального страха, когда гиппокампэктомия откладывается на четыре недели. [26] У мышей, обследованных через 4 недели после кондиционирования, метилирование и деметилирование гиппокампа были обращены вспять (гиппокамп необходим для формирования воспоминаний, но воспоминания там не хранятся), в то время как существенное дифференциальное метилирование и деметилирование CpG происходило в корковых нейронах во время поддержания памяти. Через четыре недели после контекстуального формирования страха в передней поясной извилине мышей (см. рисунок) было обнаружено 1223 дифференциально метилированных гена. Таким образом, хотя вскоре после формирования памяти в гиппокампе было много метилирований, все эти метилирования гиппокампа были деметилированы уже через четыре недели.
Ли и др. [27] сообщили об одном примере взаимосвязи между экспрессией белка ТЕТ, деметилированием и памятью при использовании тренировки на вымирание . Тренировка угасания — это исчезновение ранее усвоенного поведения, когда это поведение не подкрепляется.
Сравнение образцов нейронов инфралимбической префронтальной коры (ILPFC), полученных от мышей, обученных бояться звукового сигнала, и мышей, обученных угашению, выявило драматические зависимые от опыта общегеномные различия в накоплении 5-hmC в ILPFC в ответ на обучение. Тренировка на вымирание привела к значительному увеличению уровней информационной РНК TET3 в корковых нейронах. TET3 выборочно активировался в неокортексе взрослого человека в зависимости от опыта.
Короткая шпилька РНК (shRNA) представляет собой искусственную молекулу РНК с тугим шпильочным витком, которую можно использовать для подавления экспрессии целевого гена посредством РНК-интерференции . Мыши, обученные в присутствии shRNA, нацеленной на TET3, показали значительное ухудшение памяти на угасание страха. [27]
Прилежащее ядро ( NAc) играет важную роль в развитии зависимости . В прилежащем ядре мышей повторное воздействие кокаина приводило к снижению информационной РНК (мРНК) TET1 и снижению экспрессии белка TET1. Аналогичным образом, наблюдалось снижение мРНК TET1 примерно на 40% в NAc у людей, употребляющих кокаин, исследованных посмертно. [28]
Как указано выше в отношении обучения и памяти, короткая шпильчная РНК (shRNA) представляет собой искусственную молекулу РНК с тугим шпильочным поворотом, которую можно использовать для подавления экспрессии целевого гена посредством РНК-интерференции . Фэн и др. [28] вводили shRNA, нацеленную на TET1, в NAc мышей. Это может снизить экспрессию TET1 так же, как снижение экспрессии TET1 при воздействии кокаина. Затем они использовали косвенный показатель зависимости — обусловленное предпочтение места . Условное предпочтение места может измерять количество времени, которое животное проводит в районе, который был связан с воздействием кокаина, и это может указывать на пристрастие к кокаину. Снижение экспрессии Tet1 , вызванное введением shRNA в NAc, значительно усиливает кондиционирование кокаинового места.
Как описано в статье Ноцицепция , ноцицепция — это реакция сенсорной нервной системы на вредные раздражители, такие как токсичное химическое вещество, нанесенное на ткань. При ноцицепции химическая стимуляция сенсорных нервных клеток, называемых ноцицепторами , производит сигнал, который передается по цепочке нервных волокон через спинной мозг в головной мозг . Ноцицепция вызывает различные физиологические и поведенческие реакции и обычно приводит к субъективному ощущению или восприятию боли .
Работа Пана и др. [3] впервые показали, что белки ТЕТ1 и ТЕТ3 в норме присутствуют в спинном мозге мышей. Они использовали модель, вызывающую боль, путем внутриподошвенной инъекции 5% формалина в дорсальную поверхность задней лапы мыши и измеряли время облизывания задней лапы как меру вызванной боли. Экспрессия белков ТЕТ1 и ТЕТ3 увеличилась на 152% и 160% соответственно через 2 часа после инъекции формалина. Принудительное снижение экспрессии TET1 или TET3 путем спинальной инъекции Tet1-siRNA или Tet3-siRNA в течение трех дней подряд перед инъекцией формалина облегчало восприятие боли у мышей. С другой стороны, принудительная сверхэкспрессия TET1 или TET3 в течение 2 дней подряд значительно вызывала болевое поведение, о чем свидетельствует снижение у мышей термического болевого порога.
Они также показали, что ноцицептивные болевые эффекты возникают за счет опосредованного ТЕТ превращения 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в промоторе микроРНК, обозначенной miR -365-3p , тем самым увеличивая ее экспрессию. Эта микроРНК, в свою очередь, обычно нацеливается на информационную РНК Kcnh2 (уменьшает ее экспрессию) , которая кодирует белок, известный как K v 11.1 или KCNH2. KCNH2 представляет собой альфа- субъединицу калиевого ионного канала в центральной нервной системе . Принудительное снижение экспрессии TET1 или TET3 посредством предварительной инъекции siRNA обратило вспять снижение уровня белка KCNH2 у мышей, получавших формалин.