Флуоресцентная визуализация

Тип неинвазивного метода визуализации

Многоцветное флуоресцентное изображение живых клеток HeLa

Флуоресцентная визуализация — это тип неинвазивной техники визуализации, которая может помочь визуализировать биологические процессы, происходящие в живом организме. Изображения могут быть получены различными методами, включая: микроскопию , зонды визуализации и спектроскопию .

Сама флуоресценция является формой люминесценции , которая возникает в результате испускания веществом света определенной длины волны после поглощения электромагнитного излучения . Молекулы, которые повторно испускают свет при поглощении света, называются флуорофорами . ^{[1] [2]}

Флуоресцентная визуализация фотографирует флуоресцентные красители и флуоресцентные белки, чтобы отметить молекулярные механизмы и структуры. Она позволяет экспериментально наблюдать динамику экспрессии генов , экспрессии белков и молекулярных взаимодействий в живой клетке. ^[3] По сути, она служит точным количественным инструментом для биохимических приложений.

Распространенное заблуждение, флуоресценция отличается от биолюминесценции тем, как белки из каждого процесса производят свет. Биолюминесценция — это химический процесс, в котором ферменты расщепляют субстрат для производства света. Флуоресценция — это физическое возбуждение электрона и последующее возвращение для испускания света.

Атрибуты

Механизм флуоресценции

Диаграмма, показывающая связь между поглощением и флуоресценцией

Когда определенная молекула поглощает свет, энергия молекулы на короткое время повышается до более высокого возбужденного состояния. Последующее возвращение в основное состояние приводит к излучению флуоресцентного света, который можно обнаружить и измерить. Излученный свет, возникающий в результате поглощения фотона энергии hv , имеет определенную длину волны. Важно знать эту длину волны заранее, чтобы во время проведения эксперимента измерительный прибор знал, какую длину волны следует установить для обнаружения излучения света. Эта длина волны определяется уравнением:

${\displaystyle \lambda _{\text{emission}}=\ {\frac {hc}{{Energy}_{\text{emission}}}}}$

где h = постоянная Планка, а c = скорость света. Обычно здесь используется большое сканирующее устройство или ПЗС для измерения интенсивности и цифровой фотографии изображения. ^[1]

Флуоресцентные красители против белков

Флуоресцентные красители, не требующие времени созревания, обеспечивают более высокую фотостабильность и яркость по сравнению с флуоресцентными белками. С точки зрения яркости, светимость зависит от коэффициента затухания флуорофоров или способности поглощать свет, а также от их квантовой эффективности или эффективности преобразования поглощенного света в флуоресцентно излучаемую люминесценцию. Сами красители не очень флуоресцентны, но когда они связываются с белками, их становится легче обнаружить. Один из примеров, NanoOrange, связывается с покрытием и гидрофобными областями белка, будучи невосприимчивым к восстановителям. Что касается белков, эти молекулы сами будут флуоресцировать, когда они поглощают определенную длину волны падающего света. Один из примеров этого, зеленый флуоресцентный белок (GFP), флуоресцирует зеленым при воздействии света в диапазоне от синего до УФ. Флуоресцентные белки являются превосходными репортерными молекулами, которые могут помочь в локализации белков, наблюдении за связыванием белков и количественной оценке экспрессии генов. ^[1]

Диапазон изображения

Поскольку некоторые длины волн флуоресценции выходят за пределы диапазона человеческого глаза, для точного обнаружения света и отображения излучения используются приборы с зарядовой связью (ПЗС). Обычно это происходит в диапазоне 300–800 нм. Одним из преимуществ флуоресцентной сигнализации является то, что интенсивность испускаемого света ведет себя довольно линейно по отношению к количеству предоставленных флуоресцентных молекул. Это, очевидно, обусловлено тем, что интенсивность поглощенного света и длина волны постоянны. Что касается самого изображения, оно обычно находится в 12-битном или 16-битном формате данных. ^[1]

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) подсвечивается УФ-светом у трех лабораторных мышей

Системы визуализации

Основными компонентами систем флуоресцентной визуализации являются:

• Источник возбуждения: устройство, которое создает либо источник с широкой длиной волны, например, УФ-свет, либо источник с узкой длиной волны, например, лазер.
• Оптика светового дисплея: механизм, при котором свет освещает образец. Обычно это делается путем прямого освещения образца.
• Оптика распределения света: метод сбора самого света. Обычно это линзы, зеркала и фильтры.
• Фильтрация испускаемого света: оптические фильтры гарантируют, что отраженный и рассеянный свет не будет включен в флуоресценцию. Три класса эмиссионных фильтров: длиннополосные, короткополосные и полосовые.
• Обнаружение, усиление и визуализация: для обнаружения и количественной оценки испускаемых фотонов используется фотоумножитель (ФЭУ) или прибор с зарядовой парой (ПЗС).

Приложения

• В ПЦР (электрофорез в агарозном геле): SYBR Green — очень распространенный краситель, который связывается с ДНК и используется для визуализации полос ДНК в агарозном геле. Краситель поглощает синий свет и флуоресцирует зеленым для захвата системой визуализации.
• Блоттинг (вестерн, нозерн и саузерн): флуорохромы могут связываться с антителами, РНК и ДНК для флуоресценции и количественной оценки данных.
• Секвенирование ДНК: секвенирование по Сэнгеру — это распространенная форма обнаружения нуклеиновых кислот, которая может использовать флуоресцентно меченые ddNTP для визуализации пиков флуоресценции.
• Хирургия с использованием флуоресцентного изображения: это подход к медицинской визуализации, при котором флуоресцентно маркируется масса для облегчения навигации. Например, индоцианин зеленый может использоваться для обнаружения лимфатических узлов у онкологических больных. ^[4]
• Флуоресцентная визуализация с точностью до одного нанометра (FIONA): использует освещение с полным внутренним отражением для снижения шума и увеличения яркости флуорофоров ^[5]
• Кальциевая визуализация: метод, который использует флуоресцентные молекулы, называемые кальциевыми индикаторами, которые меняют флуоресценцию при связывании с ионами Ca ²⁺ . Это ключевая часть в наблюдении за тем, когда клетки активны в нервной системе. ^[6]
• Пегулицианин (Lumisight) показан для флуоресцентной визуализации у взрослых с раком молочной железы в качестве вспомогательного средства для интраоперационного обнаружения раковой ткани в полости резекции после удаления первичного образца во время операции лампэктомии. ^[7]
• Фотоактивируемая локализационная микроскопия .

Агарозный гель с использованием бромистого этидия в качестве флуоресцентной метки при освещении УФ-светом

Виды микроскопии

Для изменения визуализации и контрастности изображения можно использовать различные методы микроскопии. Каждый метод имеет свои плюсы и минусы, но все они используют один и тот же механизм флуоресценции для наблюдения за биологическим процессом.

• Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения: метод микроскопии, который использует затухающие волны для выборочного наблюдения флуоресценции отдельной молекулы. ^[8]
• Флуоресцентная микроскопия с использованием светового листа: метод флуоресцентной микроскопии, при котором тонкий срез образца освещается под перпендикулярным углом исследования. ^[9]
• Микроскопия изображений с использованием флуоресцентной визуализации в течение всей жизни: метод визуализации, который регистрирует изменения флуоресценции с течением времени.

Преимущества

• Неинвазивность: визуализация in vivo может осуществляться без прокола кожи
• Чувствительность: зонды разработаны таким образом, чтобы быть чрезвычайно чувствительными к обнаружению биологических молекул, таких как ДНК, РНК и белки. ^[1]
• Многократная маркировка: в образцах можно обнаружить несколько флуорохромов, что позволяет легко интегрировать стандарты и контроль.
• Стабильность меченых молекул: флуоресцентно меченые молекулы, используемые в визуализации, могут храниться в течение месяцев, в то время как другие молекулы, например, те, которые мечены радиоактивными изотопами, распадаются в течение нескольких дней. ^[9]
• Относительно безопасно в обращении: большинство флуорофоров можно безопасно и достаточно эффективно обрабатывать в перчатках, в то время как, например, радиоизотопы могут потребовать свинцовых экранов или другой защиты от радиации. ^[9]
• Простая утилизация: многие флуорофоры требуют минимальных методов утилизации, в то время как радиоактивные отходы требуют регулируемой утилизации и долгосрочного обращения. Это также помогает снизить затраты, необходимые для утилизации этих продуктов.

Недостатки

Пример флуоресцентного микроскопа с прибором с зарядовой связью (ПЗС) для захвата изображений

• Фотообесцвечивание: распространенная проблема флуорофоров, при которой постоянное переключение между основным и возбужденным состояниями повреждает молекулу и снижает ее интенсивность. ^[9]
• Восприимчивость к окружающей среде: такие факторы окружающей среды, как температура, концентрация ионов и pH, могут влиять на эффективность и излучение флуорохромов.
• Токсичность: флуорохромы Aome могут быть токсичны для клеток, тканей in vivo или вызывать мутации. ^[10]
• Ограниченная разрешающая способность: Флуоресцентные микроскопы ограничены в своей способности различать близкие объекты на макроскопическом уровне. Для сравнения, электронные микроскопы, например, обладают способностью разрешать в гораздо меньшем диапазоне.
• Ограниченный начальный диапазон светимости: интенсивность источника падающего света имеет предел и за его пределами может привести к фотодеструкции молекул. ^[1]

В целом, эта форма визуализации чрезвычайно полезна в передовых исследованиях, поскольку позволяет отслеживать биологические процессы. Переход от 2D-флуоресцентных изображений к 3D-изображениям позволил ученым лучше изучить пространственную точность и разрешение. Кроме того, сосредоточив усилия на 4D-анализе, ученые теперь могут отслеживать клетку в реальном времени, что позволяет им отслеживать быстродействующие процессы.

Будущие направления

Различные цвета флуоресценции в зависимости от спектра флуоресцентных белков

Разработка более эффективных флуоресцентных белков — это задача, которую взяли на себя многие ученые, чтобы улучшить возможности зондов визуализации. Часто мутации в определенных остатках могут значительно изменить флуоресцентные свойства белка. Например, путем мутации гена F64L в GFP медузы белок способен более эффективно флуоресцировать при 37 °C, что является важным атрибутом при выращивании культур в лаборатории. ^[11] В дополнение к этому, генная инженерия может производить белок, который излучает свет на лучшей длине волны или частоте. ^[11] Кроме того, сама окружающая среда может играть решающую роль. Время жизни флуоресценции можно стабилизировать в полярной среде.

Механизмы, которые были хорошо описаны, но не обязательно включены в практические приложения, имеют многообещающий потенциал для флуоресцентной визуализации. Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) является чрезвычайно чувствительным механизмом, который производит сигнальные молекулы в диапазоне 1–10 нм. ^[8]

Улучшения в методах, которые составляют флуоресцентные процессы, также имеют решающее значение для более эффективных конструкций. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) — это метод анализа, который наблюдает за флуктуацией интенсивности флуоресценции. Этот анализ является компонентом многих флуоресцентных машин для визуализации, и улучшения в пространственном разрешении могут улучшить чувствительность и диапазон. ^[8]

Разработка более чувствительных зондов и аналитических методов для лазерно-индуцированной флуоресценции может позволить получать более точные и актуальные экспериментальные данные.

Смотрите также

• Флуоресценция в науках о жизни
• Флуоресцентный микроскоп

Ссылки

1. "Принципы и методы флуоресцентной визуализации" (PDF) . Бостонский университет . Декабрь 2012 г.
2. Сирбу, Думитру; Лули, Саймир; Лесли, Джек; Окли, Фиона; Беннистон, Эндрю К. (17.05.2019). «Улучшенная in vivo оптическая визуализация воспалительного ответа на острое повреждение печени у мышей C57BL/6 с использованием очень яркого ближнего инфракрасного красителя BODIPY». ChemMedChem . 14 (10): 995–999. doi :10.1002/cmdc.201900181. ISSN  1860-7179. PMID  30920173. S2CID  85544665.
3. "Флуоресцентная визуализация — Последние исследования и новости". Nature . Получено 2019-04-18 .
4. Нагая, Таданобу; Накамура Ю А.; Чойк, Питер Л.; Кобаяши, Хисатака (22 декабря 2017 г.). «Хирургия под флуоресцентным контролем». Границы онкологии . 7 : 314. doi : 10.3389/fonc.2017.00314 . ISSN  2234-943Х. ПМЦ 5743791 . ПМИД  29312886. 
5. Йылдыз, Ахмет; Селвин, Пол Р. (2005-07-01). «Флуоресцентная визуализация с точностью в один нанометр: применение в молекулярных двигателях». Accounts of Chemical Research . 38 (7): 574–582. doi :10.1021/ar040136s. ISSN  0001-4842. PMID  16028892.
6. "Флуоресцентная микроскопия — плюсы и минусы". DNA Learning Center . Получено 2019-04-18 .
7. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/appletter/2024/214511Orig1s000ltr.pdf В данной статье использован текст из этого источника, который находится в общественном достоянии .
8. Хауштайн, Эльке; Швилле, Петра (сентябрь 2007 г.). «Тенденции в области флуоресцентной визуализации и связанных с ней методов получения биологической информации». Журнал HFSP . 1 (3): 169–180. doi :10.2976/1.2778852. ISSN  1955-2068 . PMC 2640989. PMID  19404444. 
9. Forero-Shelton, Manu (апрель 2019 г.). «Вглядываться в клетки с высоким разрешением стало проще». Nature Methods . 16 (4): 293–294. doi :10.1038/s41592-019-0373-3. ISSN  1548-7105. PMID  30886415. S2CID  81982416.
10. Alford, Raphael; Simpson, Haley M.; Duberman, Josh; Hill, G. Craig; Ogawa, Mikako; Regino, Celeste; Kobayashi, Hisataka; Choyke, Peter L. (2009-11-01). "Токсичность органических флуорофоров, используемых в молекулярной визуализации: обзор литературы". Molecular Imaging . 8 (6): 341–354. doi : 10.2310/7290.2009.00031 . ISSN  1536-0121. PMID  20003892.
11. Piston, David W.; Davidson, Michael W.; Cranfill, Paula J.; Gilbert, Sarah G.; Kremers, Gert-Jan (15.01.2011). «Краткий обзор флуоресцентных белков». J Cell Sci . 124 (2): 157–160. doi :10.1242/jcs.072744. ISSN  0021-9533. PMC 3037093. PMID 21187342  . 

Дальнейшее чтение

• Ю, Джао; Харанхедкар, Шефали; Набатилан, Ариэль; Фарни, Кристофер (2021). «Глава 4: Визуализация следовых количеств металлов в биологических системах». В Kroneck, Peter MH; Sosa Torres, Martha (ред.). Металлы, микробы и минералы: биогеохимическая сторона жизни . Том 21 в серии Ионы металлов в науках о жизни. Берлин: Walter de Gruyter. стр. 81–134. doi :10.1515/9783110589771-010. ISBN 9783110589771. S2CID  240664558 (требуется подписка) .{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) CS1 maint: postscript ( ссылка )