Флуорофор (или флуорохром , аналогично хромофору ) — флуоресцентное химическое соединение , способное переизлучать свет при световом возбуждении. Флуорофоры обычно содержат несколько объединенных ароматических групп или плоские или циклические молекулы с несколькими π-связями . [1]
Флуорофоры иногда используются отдельно, в качестве индикатора в жидкостях, в качестве красителя для окрашивания определенных структур, в качестве субстрата ферментов или в качестве зонда или индикатора (когда на его флуоресценцию влияют такие факторы окружающей среды, как полярность или ионы). В более общем смысле они ковалентно связаны с макромолекулами , служа маркерами (или красителями, или метками, или репортерами) для аффинных или биоактивных реагентов ( антител , пептидов, нуклеиновых кислот). Флуорофоры особенно используются для окрашивания тканей, клеток или материалов в различных аналитических методах, таких как флуоресцентная визуализация и спектроскопия .
Флуоресцеин , через его аминореактивное изотиоцианатное производное флуоресцеинизотиоцианат (FITC), был одним из самых популярных флуорофоров . От мечения антител, благодаря карбоксифлуоресцеину , приложения распространились и на нуклеиновые кислоты . Другими исторически распространенными флуорофорами являются производные родамина (TRITC), кумарина и цианина . [2] Новые поколения флуорофоров, многие из которых являются запатентованными, часто работают лучше, будучи более фотостабильными, более яркими или менее чувствительными к pH , чем традиционные красители с сопоставимым возбуждением и излучением. [3] [4]
флуоресценция
Флуорофор поглощает световую энергию определенной длины волны и повторно излучает свет с большей длиной волны. Поглощаемые длины волн , эффективность передачи энергии и время до испускания зависят как от структуры флуорофора, так и от его химического окружения, поскольку молекула в возбужденном состоянии взаимодействует с окружающими молекулами. Длины волн максимального поглощения (≈ возбуждения) и излучения (например, поглощение/испускание = 485 нм/517 нм) являются типичными терминами, используемыми для обозначения данного флуорофора, но может быть важно учитывать весь спектр. Спектр длин волн возбуждения может быть очень узким или более широким, или же он может находиться за пределами предельного уровня. Спектр излучения обычно острее, чем спектр возбуждения, имеет большую длину волны и, соответственно, меньшую энергию. Энергии возбуждения варьируются от ультрафиолета до видимого спектра , а энергии излучения могут продолжаться от видимого света до ближней инфракрасной области.
Основными характеристиками флуорофоров являются:
Максимальная длина волны возбуждения и излучения (выраженная в нанометрах (нм)): соответствует пику в спектрах возбуждения и излучения (обычно по одному пику в каждом).
Молярный коэффициент поглощения (в моль -1 см -1 ): связывает количество поглощенного света при данной длине волны с концентрацией флуорофора в растворе.
Квантовый выход : эффективность передачи энергии от падающего света к испускаемой флуоресценции (количество испускаемых фотонов на поглощенный фотон).
Время жизни (в пикосекундах): продолжительность возбужденного состояния флуорофора до возвращения в основное состояние. Это относится к времени, за которое популяция возбужденных флуорофоров распадется до 1/ e (≈0,368) от исходного количества.
Стоксов сдвиг : разница между максимальной длиной волны возбуждения и максимальной длиной излучения.
Темная фракция : доля молекул, неактивных в излучении флуоресценции. Что касается квантовых точек , длительная микроскопия одиночных молекул показала, что 20–90% всех частиц никогда не излучают флуоресценцию. [5] С другой стороны, наночастицы сопряженного полимера (Pdots) практически не обнаруживают темной фракции в своей флуоресценции. [6] Флуоресцентные белки могут иметь темную фракцию из-за неправильного сворачивания белка или дефектного образования хромофора. [7]
Эти характеристики определяют другие свойства, включая фотообесцвечивание или фоторезистентность (потеря флуоресценции при непрерывном световом возбуждении). Следует учитывать и другие параметры, такие как полярность молекулы флуорофора, размер и форма флуорофора (т.е. характер поляризационной флуоресценции ) и другие факторы, которые могут изменить поведение флуорофоров.
Большинство флуорофоров представляют собой органические небольшие молекулы из 20–100 атомов (200–1000 Дальтон ; молекулярная масса может быть выше в зависимости от привитых модификаций и конъюгированных молекул), но существуют также гораздо более крупные природные флуорофоры, которые представляют собой белки : зеленый флуоресцентный белок (GFP). составляет 27 кДа , а некоторые фикобилипротеины (PE, APC...) — ≈240 кДа. По состоянию на 2020 год самым маленьким известным флуорофором считался 3-гидроксиизоникотинальдегид , соединение из 14 атомов и массой всего 123 Да. [8]
Флуоресцентные частицы, такие как квантовые точки (диаметр 2–10 нм, 100–100 000 атомов), также считаются флуорофорами. [9]
Размер флуорофора может стерически препятствовать меченой молекуле и влиять на полярность флуоресценции.
Семьи
Флуоресценция различных веществ в УФ-свете. Зеленый — флуоресцеин , красный — родамин Б , желтый — родамин 6G , синий — хинин , фиолетовый — смесь хинина и родамина 6г. Растворы имеют концентрацию около 0,001% в воде.
Молекулы флуорофора могут использоваться либо отдельно, либо служить флуоресцентным мотивом функциональной системы. В зависимости от молекулярной сложности и методов синтеза молекулы флуорофоров обычно можно разделить на четыре категории: белки и пептиды, небольшие органические соединения, синтетические олигомеры и полимеры и многокомпонентные системы. [10] [11]
Флуоресцентные белки GFP, YFP и RFP (зеленый, желтый и красный соответственно) могут присоединяться к другим специфическим белкам с образованием слитого белка , синтезируемого в клетках после трансфекции подходящего плазмидного носителя.
Небелковые органические флуорофоры принадлежат к следующим основным химическим семействам:
Эти флуорофоры флуоресцируют за счет делокализованных электронов , которые могут перепрыгивать зону и стабилизировать поглощенную энергию. Например, бензол , один из простейших ароматических углеводородов, возбуждается при 254 нм и излучает при 300 нм. [12] Это отличает флуорофоры от квантовых точек, которые представляют собой флуоресцентные полупроводниковые наночастицы .
Кроме того, могут присутствовать различные функциональные группы, изменяющие их свойства, такие как растворимость, или придающие особые свойства, например, бороновая кислота , которая связывается с сахарами, или несколько карбоксильных групп , связывающихся с определенными катионами. Когда краситель содержит электронодонорную и электроноакцепторную группы на противоположных концах ароматической системы, этот краситель, вероятно, будет чувствителен к полярности окружающей среды ( сольватохромный ), поэтому его называют чувствительным к окружающей среде. Часто красители используются внутри клеток, непроницаемых для заряженных молекул; в результате этого карбоксильные группы превращаются в сложный эфир, который удаляется внутриклеточными эстеразами, например фура-2АМ и флуоресцеин-диацетатом.
Следующие семейства красителей являются группами товарных знаков и не обязательно имеют структурное сходство.
Ядра эндотелиальных клеток бычьей легочной артерии окрашены в синий цвет с помощью DAPI , митохондрии окрашены в красный цвет с помощью MitoTracker Red CMXRos и F-актин окрашен в зеленый цвет с помощью фаллоидина Alexa Fluor 488 и визуализированы с помощью флуоресцентного микроскопа.
^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 3 Красители и флюорохромы». Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. стр. 61–95. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 г.
^ Ритдорф Дж (2005). Микроскопические методы. Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии. Берлин: Шпрингер. стр. 246–9. ISBN3-540-23698-8. Проверено 13 декабря 2008 г.
^ аб Цянь Р.Ю.; Вагонер А (1995). «Флуорофоры для конфокальной микроскопии». В Поли Дж.Б. (ред.). Справочник по биологической конфокальной микроскопии . Нью-Йорк: Пленум Пресс. стр. 267–74. ISBN0-306-44826-2. Проверено 13 декабря 2008 г.
^ Лакович, младший (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии (3-е изд.). Спрингер. п. 954. ИСБН978-0-387-31278-1.
^ Понс Т., Мединц И.Л., Фаррелл Д., Ван X, Граймс А.Ф., Инглиш Д.С., Берти Л., Маттусси Х (2011). «Исследования колокализации одиночных молекул проливают свет на идею полностью излучающих и темных одиночных квантовых точек». Маленький . 7 (14): 2101–2108. дои : 10.1002/smll.201100802. ПМИД 21710484.
^ Конер А.Л., Крндиджа Д., Хоу К., Шерратт Д.Д., Ховарт М. (2013). «Наночастицы сопряженного полимера с гидроксильными концевыми группами имеют яркую фракцию, близкую к единице, и обнаруживают зависимость от холестерина нанодоменов IGF1R». АСУ Нано . 7 (2): 1137–1144. дои : 10.1021/nn3042122 . ПМЦ 3584654 . ПМИД 23330847.
^ Козенс, Том (16 декабря 2020 г.). «Флуоресцентная молекула бьет рекорд размера среди красителей, излучающих зеленый цвет». chemistryworld.com . Проверено 3 декабря 2021 г.
^ Ли Z, Чжао X, Хуан С, Гун X (2019). «Последние достижения в производстве экологически чистых люминесцентных солнечных концентраторов с использованием нетоксичных квантовых точек в качестве флуорофоров». Дж. Матер. хим. С. 7 (40): 12373–12387. дои : 10.1039/C9TC03520F. S2CID 203003761.
^ Лю, Дж.; Лю, К.; Он, В. (2013), «Флуорофоры и их применение в качестве молекулярных зондов в живых клетках», Curr. Орг. хим. , 17 (6): 564–579, дои : 10.2174/1385272811317060003
^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 4. Флуоресцентные этикетки». Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. стр. 96–134. ISBN978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 г.
^ Omlc.ogi.edu
^ abcde Колумбия Биологические науки
^ Биндельс, Дафна С.; Хаарбош, Линдси; ван Вирен, Лаура; Постма, Мартен; Визе, Катрин Э.; Мастоп, Марике; Омонье, Сильвен; Готард, Гийом; Руайан, Антуан; Хинк, Марк А.; Гаделла, Теодор WJ (январь 2017 г.). «mScarlet: яркий мономерный красный флуоресцентный белок для визуализации клеток». Природные методы . 14 (1): 53–56. дои : 10.1038/nmeth.4074. ISSN 1548-7105. PMID 27869816. S2CID 3539874.
^ Сырбу, Дмитрий; Лули, Саймир; Лесли, Джек; Окли, Фиона; Беннистон, Эндрю К. (2019). «Улучшенная оптическая визуализация in vivo воспалительной реакции на острое повреждение печени у мышей C57BL/6 с использованием очень яркого красителя BODIPY, работающего в ближнем инфракрасном диапазоне». ХимМедХим . 14 (10): 995–999. doi : 10.1002/cmdc.201900181. ISSN 1860-7187. PMID 30920173. S2CID 85544665.
^ Таки, Масаясу (2013). «Глава 5. Визуализация и зондирование кадмия в клетках». В Астрид Сигел; Хельмут Сигель; Роланд К.О. Сигел (ред.). Кадмий: от токсикологии к эссенциальности . Ионы металлов в науках о жизни. Том. 11. Спрингер. стр. 99–115. дои : 10.1007/978-94-007-5179-8_5. ПМИД 23430772.
^ Сырбу, Дмитрий; Батчер, Джон Б.; Уодделл, Пол Г.; Андрас, Питер; Беннистон, Эндрю К. (18 сентября 2017 г.). «Локально возбужденные красители с переносом заряда в состоянии, связанные с состоянием, как оптически чувствительные зонды, запускающие нейроны» (PDF) . Химия - Европейский журнал . 23 (58): 14639–14649. doi : 10.1002/chem.201703366. ISSN 0947-6539. ПМИД 28833695.
^ Цзян, Сицянь; Ван, Линфэй; Кэрролл, Шайна Л.; Чен, Цзяньвэй; Ван, Мэн К.; Ван, Цзинь (20 августа 2018 г.). «Проблемы и возможности низкомолекулярных флуоресцентных зондов в приложениях окислительно-восстановительной биологии». Антиоксиданты и окислительно-восстановительная сигнализация . 29 (6): 518–540. дои : 10.1089/ars.2017.7491. ISSN 1523-0864. ПМК 6056262 . ПМИД 29320869.
Внешние ссылки
База данных флуоресцентных красителей
Таблица флуорохромов
Справочник по молекулярным зондам — всеобъемлющий ресурс по флуоресцентной технологии и ее применению.