Хемостат

Тип биореактора

Закрытый хемостатный сосуд с непрерывным и регулируемым притоком среды и оттоком сточных вод, используемый для контролируемого роста микроорганизмов. Система поддерживает постоянный объем и уровень аэрации. Скорость роста микроорганизма контролируется путем манипулирования притоком свежей среды, в то время как плотность популяции регулируется путем изменения концентрации ограничивающего питательного вещества. Эта открытая система позволяет исследователям поддерживать экспоненциальную фазу роста клеток для использования в физиологических экспериментах. ^[1]

Хемостат (от chem ical environment is static ) — это биореактор , в который непрерывно добавляется свежая среда, в то время как культуральная жидкость, содержащая оставшиеся питательные вещества, конечные продукты метаболизма и микроорганизмы, непрерывно удаляется с той же скоростью, чтобы поддерживать постоянный объем культуры. [ ^{2] [3]} Изменяя скорость, с которой среда добавляется в биореактор, можно легко контролировать удельную скорость роста микроорганизмов .

Операция

Устойчивое состояние

Одной из важнейших особенностей хемостатов является то, что микроорганизмы можно выращивать в физиологическом устойчивом состоянии при постоянных условиях окружающей среды. В этом устойчивом состоянии рост происходит с постоянной удельной скоростью роста , и все параметры культуры остаются постоянными (объем культуры, концентрация растворенного кислорода, концентрации питательных веществ и продуктов, pH, плотность клеток и т. д.). Кроме того, условия окружающей среды могут контролироваться экспериментатором. ^[4] Микроорганизмы, растущие в хемостатах, обычно достигают устойчивого состояния из-за отрицательной обратной связи между скоростью роста и потреблением питательных веществ: если в биореакторе присутствует небольшое количество клеток, клетки могут расти со скоростью роста, превышающей скорость разбавления, поскольку они потребляют мало питательных веществ, поэтому рост меньше ограничивается добавлением ограничивающего питательного вещества с поступающей свежей средой. Ограничивающее питательное вещество — это питательное вещество, необходимое для роста, присутствующее в среде в ограничивающей концентрации (все остальные питательные вещества обычно поставляются в избытке). Однако чем больше становится количество клеток, тем больше потребляется питательных веществ, что снижает концентрацию ограничивающего питательного вещества. В свою очередь, это приведет к снижению удельной скорости роста клеток, что приведет к снижению числа клеток, поскольку они продолжают удаляться из системы с оттоком. Это приводит к стационарному состоянию. Благодаря саморегуляции стационарное состояние является стабильным. Это позволяет экспериментатору контролировать удельную скорость роста микроорганизмов, изменяя скорость насоса, подающего свежую среду в сосуд.

Хорошо смешанный

Еще одной важной особенностью хемостатов и других систем непрерывного культивирования является то, что они хорошо перемешаны, так что условия окружающей среды являются однородными или однородными, а микроорганизмы случайным образом распределены и сталкиваются друг с другом случайным образом. Поэтому конкуренция и другие взаимодействия в хемостате являются глобальными, в отличие от биопленок .

Скорость разбавления

Скорость обмена питательными веществами выражается как скорость разбавления  D. В устойчивом состоянии удельная скорость роста  μ микроорганизма равна скорости разбавления  D. Скорость разбавления определяется как поток среды в единицу времени, F , через объем  V культуры в биореакторе.

${\displaystyle D={\frac {\text{medium flow rate}}{\text{culture volume}}}={\frac {F}{V}}}$

Максимальная скорость роста и критическая скорость разбавления

Удельная скорость роста  μ обратно пропорциональна времени, необходимому для удвоения биомассы, называемому временем удвоения  t _d , следующим образом:

${\displaystyle \mu ={\frac {\ln 2}{t_{d}}}}$

Таким образом, время удвоения t _d становится функцией скорости разбавления  D в стационарном состоянии:

${\displaystyle t_{d}={\frac {\ln 2}{D}}}$

Каждый микроорганизм, растущий на определенном субстрате, имеет максимальную удельную скорость роста μ _max (скорость роста, наблюдаемая, если рост ограничен внутренними ограничениями, а не внешними питательными веществами). Если выбрана скорость разбавления выше μ _max , клетки не смогут расти с такой же скоростью, с какой они удаляются, поэтому культура не сможет поддерживать себя в биореакторе и вымоется.

Однако, поскольку концентрация ограничивающего питательного вещества в хемостате не может превышать концентрацию в корме, удельная скорость роста, которую клетки могут достичь в хемостате, обычно немного ниже максимальной удельной скорости роста, поскольку удельная скорость роста обычно увеличивается с концентрацией питательного вещества, как описано кинетикой уравнения Моно . ^{[ необходима ссылка ]} Самая высокая удельная скорость роста ( μ _max ), которую могут достичь клетки, равна критической скорости разбавления ( D' _c ):

${\displaystyle D=\mu _{\max }{S \over K_{S}+S},}$

где S — концентрация субстрата или питательного вещества в хемостате, а K _S — константа полунасыщения (это уравнение предполагает кинетику Моно).

Приложения

Исследовать

Хемостаты в исследованиях используются для исследований в области клеточной биологии в качестве источника больших объемов однородных клеток или белка. Хемостат часто используется для сбора данных о стационарном состоянии организма с целью создания математической модели, касающейся его метаболических процессов. Хемостаты также используются в качестве микрокосмов в экологии ^{[5] [6]} и эволюционной биологии. ^{[7] [8] [9] [10]} В одном случае мутация/селекция является помехой, в другом случае это желаемый изучаемый процесс. Хемостаты также могут использоваться для обогащения определенных типов бактериальных мутантов в культуре, таких как ауксотрофы или те, которые устойчивы к антибиотикам или бактериофагам, для дальнейшего научного изучения. ^[11] Изменения в скорости разбавления позволяют изучать метаболические стратегии, используемые организмами при разных скоростях роста. ^{[12] [13]}

Конкуренция за один или несколько ресурсов, эволюция путей получения и использования ресурсов, перекрестное питание/симбиоз, ^{[14] [15]} антагонизм, хищничество и конкуренция между хищниками — все это изучалось в экологии и эволюционной биологии с использованием хемостатов. ^{[16] [17] [18]}

Промышленность

Хемостаты часто используются в промышленном производстве этанола . В этом случае несколько хемостатов используются последовательно, каждый из которых поддерживается при уменьшающейся концентрации сахара. ^{[ необходима цитата ]} Хемостат также служит экспериментальной моделью непрерывных клеточных культур в биотехнологической промышленности. ^[13]

Технические проблемы

• Вспенивание приводит к переливу, при этом объем жидкости не всегда постоянен.
• Некоторые очень хрупкие клетки разрываются во время перемешивания и аэрации .
• Клетки могут расти на стенках или прилипать к другим поверхностям, ^[19] что можно преодолеть, обработав стеклянные стенки сосуда силаном, чтобы сделать их гидрофобными. Однако клетки будут отобраны для прикрепления к стенкам, поскольку те, которые это сделают, не будут удалены из системы. Те бактерии, которые прочно прилипают к стенкам, образуя биопленку, трудно изучать в условиях хемостата.
• Смешивание может быть не совсем равномерным, что нарушает «статические» свойства хемостата.
• Капание среды в камеру фактически приводит к небольшим импульсам питательных веществ и, следовательно, колебаниям концентраций, что снова нарушает «статические» свойства хемостата.
• Бактерии довольно легко перемещаются вверх по течению. Они быстро достигнут резервуара стерильной среды, если только путь жидкости не будет прерван воздушным разрывом, в котором среда падает каплями через воздух.

Постоянные усилия по исправлению каждого дефекта приводят к изменениям в базовом хемостате довольно регулярно. Примеров в литературе много.

• Для подавления пенообразования используются пеногасители.
• Перемешивание и аэрацию можно проводить осторожно.
• Для уменьшения роста стенок было предпринято множество подходов ^{[20] [21]}
• Различные приложения используют лопасти, барботирование или другие механизмы для перемешивания ^[22]
• Капание можно сделать менее заметным, используя меньшие капли и больший объем сосудов.
• Многие улучшения направлены на устранение угрозы загрязнения.

Соображения относительно экспериментального дизайна

Выбор и настройка параметров

^[23]

• Концентрация стационарного состояния ограничивающего субстрата в хемостате не зависит от концентрации притока. Концентрация притока будет влиять на концентрацию клеток и, таким образом, на стационарную OD.
• Несмотря на то, что предельная концентрация субстрата в хемостате обычно очень низка и поддерживается дискретными высококонцентрированными импульсами притока, на практике временное изменение концентрации внутри хемостата невелико (несколько процентов или меньше) и, таким образом, может рассматриваться как квазистационарное состояние.
• Время, необходимое для того, чтобы плотность клеток (OD) достигла стационарного значения (перерегулирование/недорегулирование), часто будет длительным (множественные обороты хемостата), особенно когда начальный инокулят большой. Но это время можно минимизировать, выбрав правильный параметр.

Устойчивый рост

^[23]

• Хемостат может казаться находящимся в устойчивом состоянии, но захват мутантных штаммов может происходить непрерывно, даже если его невозможно обнаружить с помощью мониторинга макромасштабных параметров, таких как OD или концентрации продукта.
• Лимитирующий субстрат обычно находится в таких низких концентрациях, что его невозможно обнаружить. В результате концентрация ограничивающего субстрата может значительно меняться с течением времени (в процентном отношении), поскольку различные штаммы захватывают популяцию, даже если результирующие изменения в OD слишком малы для обнаружения.
• «Импульсный» хемостат (с очень большими импульсами притока) имеет существенно более низкую селективную способность, чем стандартный квазинепрерывный хемостат, для мутантного штамма с повышенной приспособленностью в ограничивающих условиях.
• Резко снижая концентрацию субстрата, ограничивающего приток, можно временно подвергнуть клетки относительно более жестким условиям, пока хемостат не стабилизируется и не вернется в устойчивое состояние (по временному порядку скорости разбавления D).

Мутация

^[23]

• Некоторые типы мутантных штаммов появятся быстро:
  • Если существует SNP , который может повысить приспособленность, он должен появиться в популяции всего лишь после нескольких удвоений хемостата, для типично больших хемостатов (например, 10^11 клеток E. coli ).
  • Штамм, которому требуются два определенных SNP, где только их комбинация дает преимущество в приспособленности (тогда как каждый из них по отдельности нейтрален), вероятно, появится только в том случае, если целевой размер (количество различных местоположений SNP, которые приводят к выгодной мутации) для каждого SNP очень велик.
• Появление других типов мутантных штаммов (например, два SNP с небольшим размером мишени, большее количество SNP или в меньших хемостатах) крайне маловероятно.
  • Эти другие мутации ожидаются только через последовательные зачистки мутантов с преимуществом в приспособленности. Можно ожидать, что множественные мутанты возникнут только в том случае, если каждая мутация будет независимо полезной, а не в случаях, когда мутации по отдельности нейтральны, но вместе полезны. Последовательные захваты — единственный надежный способ для эволюции продолжаться в хемостате.
• Кажущийся экстремальным сценарий, в котором мы требуем, чтобы каждый возможный одиночный SNP сосуществовал хотя бы один раз в хемостате, на самом деле весьма вероятен. Большой хемостат с большой вероятностью достигнет этого состояния.
• Для большого хемостата ожидаемое время до появления полезной мутации будет порядка времени оборота хемостата. Обратите внимание, что это обычно существенно короче времени, необходимого полезному штамму для захвата популяции хемостата. Это не обязательно так в маленьком хемостате.
• Ожидается, что вышеуказанные пункты будут одинаковыми для различных видов, размножающихся бесполым путем ( E. coli , S. cerevisiae и т. д.).
• Более того, время до появления мутации не зависит от размера генома, но зависит от частоты мутаций на BP.
• Для характерно больших хемостатов гипермутирующий штамм не дает достаточного преимущества, чтобы оправдать его использование. Кроме того, он не имеет достаточного селективного преимущества, чтобы ожидать, что он всегда появится через случайную мутацию и захватит хемостат.

Единовременное поглощение

^[23]

• Время захвата предсказуемо, учитывая соответствующие параметры деформации.
• Различные степени разбавления избирательно благоприятствуют различным мутантным штаммам, чтобы захватить популяцию хемостата, если такой штамм существует. Например:
  • Высокая скорость разбавления создает давление отбора для мутантного штамма с повышенной максимальной скоростью роста;
  • Средний уровень разбавления создает давление отбора для мутантного штамма с более высоким сродством к ограничивающему субстрату;
  • Медленная скорость разбавления создает давление отбора для мутантного штамма, который может расти в средах без ограничивающего субстрата (предположительно, за счет потребления другого субстрата, присутствующего в среде);
• Время захвата превосходящего мутанта будет довольно постоянным в диапазоне рабочих параметров. Для характерных рабочих значений время захвата составляет порядка дней или недель.

Последовательные поглощения

^[23]

• При подходящих условиях (достаточно большая популяция и множественные цели в геноме для простых выгодных мутаций) ожидается, что множественные штаммы последовательно захватят популяцию, и сделают это относительно синхронизированным и размеренным образом. Сроки зависят от типа мутаций.
• При последовательном поглощении, даже если выборочное улучшение каждого из штаммов остается постоянным (например, каждый новый штамм лучше предыдущего на постоянный коэффициент), скорость поглощения не остается постоянной, а, скорее, уменьшается от штамма к штамму.
• Бывают случаи, когда последовательные захваты происходят так быстро, что очень трудно дифференцировать штаммы, даже при изучении частоты аллелей. Таким образом, линия множественных захватов последовательных штаммов может выглядеть как захват одного штамма с когортой мутаций.

Вариации

Установки ферментации, тесно связанные с хемостатами, — это турбидостат , ауксостат и ретентостат. В ретентостатах культуральная жидкость также удаляется из биореактора, но фильтр удерживает биомассу. В этом случае концентрация биомассы увеличивается до тех пор, пока потребность в питательных веществах для поддержания биомассы не станет равной количеству ограничивающего питательного вещества, которое может быть потреблено.

Смотрите также

• Рост бактерий
• Биохимическая инженерия
• Changestat
• Реактор непрерывного действия с мешалкой (CSTR)
• Эксперимент по долгосрочной эволюции E. coli
• Fed-batch

Ссылки

1. Мэдиган, Майкл (2015). Брок Биология микроорганизмов . Пирсон. стр. 152–153. ISBN 978-0-321-89739-8.
2. Новик А., Силард Л. (1950). «Описание хемостата». Science . 112 (2920): 715–6. Bibcode :1950Sci...112..715N. doi :10.1126/science.112.2920.715. PMID  14787503.
3. Джеймс TW (1961). «Непрерывное культивирование микроорганизмов». Annual Review of Microbiology . 15 : 27–46. doi :10.1146/annurev.mi.15.100161.000331.
4. D Herbert; R Elsworth; RC Telling (1956). «Непрерывное культивирование бактерий; теоретическое и экспериментальное исследование». J. Gen. Microbiol . 14 (3): 601–622. doi : 10.1099/00221287-14-3-601 . PMID  13346021.
5. Бекс Л., Хилькер Ф.М., Мальхов Х., Юргенс К., Арндт Х. (2005). «Экспериментальная демонстрация хаоса в микробной пищевой сети». Nature . 435 (7046): 1226–9. Bibcode :2005Natur.435.1226B. doi :10.1038/nature03627. PMID  15988524. S2CID  4380653.
6. Павлоу С., Кеврекидис ИГ. (1992). «Микробное хищничество в периодически управляемом хемостате: глобальное исследование взаимодействия между естественными и внешними частотами». Math Biosci . 108 (1): 1–55. doi :10.1016/0025-5564(92)90002-E. PMID  1550993.
7. Wichman HA, Millstein J, Bull JJ (2005). «Адаптивная молекулярная эволюция для 13 000 поколений фагов: возможная гонка вооружений». Genetics . 170 (1): 19–31. doi :10.1534/genetics.104.034488. PMC 1449705 . PMID  15687276. 
8. Dykhuizen DE, Dean AM (2004). «Эволюция специалистов в экспериментальном микрокосме». Genetics . 167 (4): 2015–26. doi :10.1534/genetics.103.025205. PMC 1470984 . PMID  15342537. 
9. Wick LM, Weilenmann H, Egli T (2002). «Кажущаяся часовая эволюция Escherichia coli в хемостатах с ограничением глюкозы воспроизводима в больших, но не в малых размерах популяции и может быть объяснена с помощью кинетики Моно». Microbiology . 148 (Pt 9): 2889–902. doi : 10.1099/00221287-148-9-2889 . PMID  12213934.
10. Джонс LE, Эллнер SP (2007). «Влияние быстрой эволюции добычи на циклы хищник-жертва». J Math Biol . 55 (4): 541–73. arXiv : q-bio/0609032 . doi :10.1007/s00285-007-0094-6. PMID  17483952. S2CID  16927689.
11. Шлегель Х.Г., Яннаш Х.В. (1967). «Обогащающие культуры». Анну. Преподобный Микробиол . 21 : 49–70. дои : 10.1146/annurev.mi.21.100167.000405. ПМИД  4860267.
12. Varma, A.; Palsson, BO (1994-10-01). «Модели баланса стехиометрического потока количественно предсказывают рост и секрецию побочных продуктов метаболизма в Escherichia coli дикого типа W3110». Applied and Environmental Microbiology . 60 (10): 3724–3731. Bibcode :1994ApEnM..60.3724V. doi :10.1128/aem.60.10.3724-3731.1994. ISSN  0099-2240. PMC 201879 . PMID  7986045. 
13. Фернандес-де-Коссио-Диас, Хорхе; Леон, Калет; Мулет, Роберто (2017-11-13). "Характеристика устойчивых состояний метаболических сетей геномного масштаба в непрерывных клеточных культурах". PLOS Computational Biology . 13 (11): e1005835. arXiv : 1705.09708 . Bibcode : 2017PLSCB..13E5835F. doi : 10.1371/journal.pcbi.1005835 . ISSN  1553-7358. PMC 5703580. PMID 29131817  . 
14. Daughton CG, Hsieh DP (1977). «Утилизация паратиона бактериальными симбионтами в хемостате». Appl. Environ. Microbiol . 34 (2): 175–84. Bibcode :1977ApEnM..34..175D. doi :10.1128/aem.34.2.175-184.1977. PMC 242618 . PMID  410368. 
15. Пфайффер Т., Бонхёффер С. (2004). «Эволюция перекрестного питания в микробных популяциях». Am. Nat . 163 (6): E126–35. doi :10.1086/383593. PMID  15266392. S2CID  31110741.
16. GJ Butler; GSK Wolkowicz (июль 1986 г.). «Конкуренция, опосредованная хищником, в хемостате». J Math Biol . 24 (2): 67–191. doi :10.1007/BF00275997. S2CID  120858390.
17. Dykhuizen DE, Hartl DL (июнь 1983). «Отбор в хемостатах». Microbiol. Rev. 47 ( 2): 150–68. doi :10.1128/mr.47.2.150-168.1983. PMC 281569. PMID  6308409 . 
18. Dykhuizen DE, Hartl DL (май 1981). «Эволюция конкурентоспособности Escherichia coli». Эволюция . 35 (3): 581–94. doi :10.2307/2408204. JSTOR  2408204. PMID  28563589.
19. Бономи А., Фредриксон АГ. (1976). «Питание простейших и рост бактериальной стенки». Biotechnol. Bioeng. 18 (2): 239–52. doi :10.1002/bit.260180209. PMID  1267931. S2CID  41343643.
20. де Креси Э., Мецгар Д., Аллен С., Пеника М., Лайонс Б., Хансен С.Дж., де Креси-Лагард V (2007). «Разработка нового устройства непрерывного культивирования для экспериментальной эволюции бактериальных популяций». Прил. Микробиол. Биотехнология. 77 (2): 489–96. дои : 10.1007/s00253-007-1168-5. PMID  17896105. S2CID  25787277.
21. Чжан З, Боккацци П, Чой ХГ, Пероцциелло Г, Сински А.Дж., Дженсен К.Ф. (2006). «Микрохемостат — микробная непрерывная культура в полимерном микробиореакторе с измерительными приборами». Lab Chip . 6 (7): 906–13. doi :10.1039/b518396k. PMID  16804595.
22. Ван Хюлле С.В., Ван Ден Брук С., Мартенс Дж., Виллес К., Шелстрете Г., Волке Э.И., Ванроллегем П.А. (2003). «Практический опыт запуска и эксплуатации лабораторного реактора ШАРОН с непрерывной аэрацией». Коммун. Сельское хозяйство. Прил. Биол. наук. 68 (2 часть А): 77–84. ПМИД  15296140.
23. Wides A, Milo R (2018). «Понимание динамики и оптимизация производительности экспериментов по селекции хемостата». arXiv : 1806.00272 [q-bio.PE].

Внешние ссылки

1. http://www.pererikstandberg.se/examensarbete/chemostat.pdf
2. https://web.archive.org/web/20060504172359/http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/Contin/chemosta.htm
3. Заключительная работа, включающая математические модели хемостата и других биореакторов.
4. Страница об одной конструкции лабораторного хемостата
5. Полное руководство по хемостату (лаборатория Данхэма). Процедуры и принципы являются общими.