Технология шлюза

Метод клонирования Gateway , изобретенный и коммерциализированный компанией Invitrogen с конца 1990-х годов, представляет собой метод клонирования реакций рекомбинации интеграции и вырезания, которые происходят, когда бактериофаг лямбда заражает бактерии. Эта технология обеспечивает быстрый и высокоэффективный способ транспортировки последовательностей ДНК в многовекторные системы для функционального анализа и экспрессии белков с использованием атт-сайтов Gateway и двух запатентованных смесей ферментов, называемых BP Clonase и LR Clonase. In vivo этим реакциям рекомбинации способствует рекомбинация сайтов прикрепления лямбда/фаговой хромосомы (attP) и бактерий (attB). В результате рекомбинации между сайтами attP и attB фаг интегрируется в бактериальный геном, окруженный двумя новыми сайтами рекомбинации (attLeft и attRight). Удаление фага из бактериальной хромосомы и регенерация сайтов attP и attB могут быть результатом рекомбинации сайтов attL и attR при определенных обстоятельствах.

Последовательности ДНК , подлежащие клонированию, добавляются к модифицированным версиям этих специальных сайтов Gateway Att. Происходят две ферментативные реакции: BP-клоназа и LR-клоназа. Клоназа BP находится между сайтами attB, окружающими вставку, и сайтами attP донорного вектора. Эта реакция катализируется смесью ферментов BP Clonase и приводит к образованию входного клона, содержащего интересующую ДНК, фланкированную доменами attL. В качестве побочного продукта реакции ген ccdB вырезается из донорного вектора. LR-клоназа возникает между областями attL созданного входного клона и областями attR целевого вектора и катализируется смесью ферментов LR-клоназы. В результате получается экспрессирующий клон с представляющей интерес ДНК, фланкированной областями attB. Как и в реакции BP, последовательность ДНК, содержащая ген ccdB, вырезается из целевого вектора.

Большие архивы клонов Gateway Entry, содержащие подавляющее большинство ORF человека, мыши и крысы ( открытые рамки считывания ), были клонированы из библиотек кДНК человека или химически синтезированы для поддержки исследовательского сообщества с использованием финансирования NIH (Национальных институтов здравоохранения) (например, Коллекция генов млекопитающих, http://mgc.nci.nih.gov/. Архивировано 25 февраля 2015 г. в Wayback Machine ). Наличие этих генных кассет в стандартной плазмиде для клонирования Gateway помогает исследователям быстро переносить эти кассеты в плазмиды, которые облегчают анализ функции генов. Клонирование шлюза действительно требует больше времени для первоначальной настройки и является более дорогим, чем традиционные методы клонирования на основе ферментов рестрикции и лигазы, но оно экономит время и предлагает более простое и высокоэффективное клонирование для последующих приложений.

Эта технология получила широкое распространение в исследовательском сообществе в области медико-биологических наук, особенно для приложений, требующих переноса тысяч фрагментов ДНК в один тип плазмиды (например, содержащей промотор CMV для экспрессии белка в клетках млекопитающих) или для переноса один фрагмент ДНК во множество различных типов плазмид (например, для экспрессии белков бактерий, насекомых и млекопитающих).

Основные этапы клонирования

Первым шагом в клонировании шлюза является подготовка клона входа в шлюз. Есть несколько разных способов клонировать запись.

1. Последовательности шлюза attB1 и attB2 добавляются к 5'- и 3'-концу фрагмента гена соответственно с использованием ген-специфичных праймеров для ПЦР и ПЦР-амплификации. Продукты ПЦР-амплификации затем смешивают с запатентованной смесью плазмид, называемой шлюзовыми «донорскими векторами» (терминология Invitrogen), и запатентованными ферментами «BP Clonase». Смесь ферментов катализирует рекомбинацию и вставку продукта ПЦР, содержащего последовательность attB, в сайты рекомбинации attP в донорном векторе Gateway. Когда кассета является частью целевой плазмиды, в номенклатуре шлюза она называется «входным клоном», а последовательности рекомбинации называются шлюзовым типом «attL».
2. Короткий конец, содержащий attL, добавляется с использованием метода TOPO, метода, при котором фрагменты ДНК клонируются в определенные векторы без необходимости использования ДНК-лигаз.
3. Желаемая последовательность ДНК может быть клонирована в сайт мультиклонирования, содержащий attL, с использованием фермента рестрикции.

Вторым шагом клонирования шлюза является подготовка вектора назначения шлюза. При подготовке экспрессионного клона важно выбрать целевой вектор, который лучше всего соответствует вашей цели. Генную кассету в клоне Gateway Entry можно затем просто и эффективно перенести в любой вектор назначения Gateway (номенклатура Invitrogen для любой плазмиды Gateway, которая содержит рекомбинационные последовательности Gateway «attR» и элементы, такие как промоторы и эпитопные метки, но не ORF ), используя запатентованная смесь ферментов «LR Clonase». Были созданы тысячи плазмид Gateway Destination, которые свободно распространяются среди исследователей по всему миру. Векторы назначения шлюза подобны классическим векторам экспрессии, содержащим несколько сайтов клонирования перед вставкой интересующего гена с использованием расщепления и лигирования рестриктазами. Векторы назначения шлюза коммерчески доступны от Invitrogen, EMD ( Novagen ) и Covalys.

Третий шаг в клонировании шлюза — это подготовка экспрессии интересующего вас гена. Обязательно используйте секвенирование или дайджест ограничений, чтобы проверить целостность экспрессионного клона. Как только ваша конструкция заработает, вы сможете трансформировать или трансфицировать клетки, которые собираетесь использовать в своих исследованиях.

Поскольку при клонировании Gateway используются запатентованные последовательности рекомбинации и запатентованные смеси ферментов, доступные только от Invitrogen, эта технология не позволяет исследователям менять поставщиков и способствует эффекту блокировки всех таких запатентованных процедур.

Подведем итог различным этапам клонирования шлюза:

• Реакция Gateway BP: ПЦР-продукт с фланкирующими сайтами att B (на этом этапе также можно использовать другие методы выделения ДНК, такие как рестрикционное расщепление) + донорский вектор, содержащий сайты attP + клоназа BP => клон Gateway Entry, содержащий сайты att L, фланкирующий интересующий ген
• Реакция LR на шлюзе: входной клон, содержащий сайты att L + целевой вектор, содержащий сайты att R, промоторы и метки + клоназа LR => клон экспрессии, содержащий сайты attB, фланкирующий интересующий ген, готовый к экспрессии гена.

Преимущества метода клонирования шлюза

Гибкость

Интересующую последовательность ДНК можно перенести в любую систему экспрессии всего за один этап рекомбинации, когда вы создадите с ее помощью входной клон.

Скорость

Вместо того, чтобы тратить два или более дней на традиционное рестрикционное и лигирование, подход Gateway позволяет создать экспрессирующую конструкцию всего за один день. Продукты attB-ПЦР также можно немедленно клонировать в целевые векторы, выполняя реакции BP и LR в одной и той же пробирке. В процессе клонирования не существует процедур рестрикции, лигирования или очистки геля.

Множественное клонирование фрагментов

Клонирование шлюза можно использовать для одновременной вставки нескольких фрагментов ДНК в многочисленные векторы в одной пробирке. Для создания необходимого экспрессионного клона можно клонировать до четырех сегментов ДНК в один шлюзовой вектор в точном порядке и ориентации в одной пробирке. Конструкция векторов шлюза делает это возможным.

Высокая эффективность

Метод шлюзового клонирования использует маркеры положительной и отрицательной селекции, чтобы повысить вероятность успешного клонирования гена. Это означает, что процесс более эффективен, а это означает, что он с большей вероятностью даст успешные результаты.

Универсальность

Все типы фрагментов ДНК можно клонировать с помощью методов ПЦР. Клонирование доступно для многих различных видов организмов, от млекопитающих до бактерий.

Смотрите также

• Клонирование
• Кассета шлюза
• Субклонирование

Рекомендации

• «Клонирование шлюза». Основы молекулярного клонирования . Термо Фишер Сайентифик.
• Хартли Дж.Л., Темпл Г.Ф., Браш Массачусетс (ноябрь 2000 г.). «Клонирование ДНК с использованием сайт-специфической рекомбинации in vitro». Геном Рез . 10 (11): 1788–95. дои : 10.1101/гр.143000. ПМК  310948 . ПМИД  11076863.
• Катцен Ф (апрель 2007 г.). «Рекомбинационное клонирование Gateway (®): биологическая операционная система». Экспертное мнение о лекарствах . 2 (4): 571–89. дои : 10.1517/17460441.2.4.571. PMID  23484762. S2CID  22606399.
• Фрейлер Ф., Стеттлер Т., Мейерхофер М., Ледер Л., Майр Л.М. (июнь 2008 г.). «Разработка новой векторной системы на основе Gateway для эффективной мультипараллельной экспрессии белков в Escherichia coli». Экспр. белка Пуриф . 59 (2): 232–41. дои : 10.1016/j.pep.2008.02.003. ПМИД  18375142.
• Хартли Дж.Л. (февраль 2003 г.). «Использование системы шлюзов для экспрессии белков у нескольких хозяев». Curr Protoc Protein Sci . Глава 5: 5.17.1–10. дои : 10.1002/0471140864.ps0517s30. ПМИД  18429245.
• Пташне, М. (1992). Генетический переключатель: фаг (лямбда) и высшие организмы . Кембридж, Массачусетс: Cell Press. ISBN 0-86542-209-5. ОСЛК  25713934.