stringtranslate.com

Экворин

Экворин представляет собой активируемый кальцием фотопротеин , выделенный из гидрозойного растения Aequorea victoria . [1] Его биолюминесценция была изучена за десятилетия до того, как белок был выделен из животного Осаму Шимомура в 1962 году. [2] У животных белок встречается вместе с зеленым флуоресцентным белком , производя зеленый свет путем резонансной передачи энергии , тогда как экворин - путем сам генерирует синий свет.

Обсуждения «ДНК медузы», которая может создавать «светящиеся» животные, часто относятся к трансгенным животным , которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, а не экворин, хотя оба изначально происходят от одного и того же животного.

Апоэкворин, белковая часть аэкворина, входит в состав пищевой добавки Преваген. Федеральная торговая комиссия США (FTC) обвинила производителя в ложной рекламе заявлений об улучшении памяти.

Открытие

Работа над экворином началась с Э. Ньютона Харви в 1921 году. [3] Хотя Харви не смог продемонстрировать классическую реакцию люцифераза - люциферин , он показал, что вода может производить свет из высушенных фотоцитов и что свет может производиться даже в отсутствие кислорода. . Позже, в 1961 году, Осаму Симомура начал работу над биолюминесценцией Aequorea . Это включало утомительный сбор десятков тысяч медуз в доках Фрайдей-Харбор, штат Вашингтон . [1] Было установлено, что свет может быть получен из экстрактов морской воды, а точнее, кальция . [2] Также было отмечено, что во время экстракции животное излучает зеленый свет из-за присутствия зеленого флуоресцентного белка , который меняет естественный синий свет экворина на зеленый. [4]

Хотя основное внимание в его работе уделялось биолюминесценции, [5] Шимомура и двое других, Мартин Чалфи и Роджер Тсиен , были удостоены Нобелевской премии в 2008 году за работу над зелеными флуоресцентными белками .

Состав

Экворин представляет собой голопротеин , состоящий из двух отдельных единиц: апопротеина , называемого апоэкворином , который имеет приблизительную молекулярную массу 21 кДа , и простетической группы целентеразина , люциферина. [6] То есть апоэкворин — это фермент , вырабатываемый в фотоцитах животного, а целентеразин — это субстрат, окисление которого фермент катализирует. Когда целентеразин связан, его называют экворином. Примечательно, что белок содержит три мотива руки EF , которые функционируют как сайты связывания ионов Ca 2+ . [7] Белок является членом суперсемейства кальций-связывающих белков, из которых существует около 66 подсемейств. [8]

Кристаллическая структура показала, что экворин связывает целентеразин и кислород в форме пероксида целентеразин-2-гидропероксида. [9] Сайт связывания первых двух атомов кальция имеет в 20 раз большее сродство к кальцию, чем третий сайт. [10] Однако более ранние утверждения о том, что только две EF-руки связывают кальций [11] были подвергнуты сомнению, когда более поздние структуры показали, что все три сайта действительно могут связывать кальций. [12] Таким образом, исследования титрования показывают, что все три сайта связывания кальция активны, но для запуска ферментативной реакции необходимы только два иона. [13]

Другие исследования показали наличие внутренней цистеиновой связи , поддерживающей структуру экворина. [14] Это также объяснило необходимость использования тиолового реагента, такого как бета-меркаптоэтанол, для регенерации белка, поскольку такие реагенты ослабляют сульфгидрильные связи между остатками цистеина , ускоряя регенерацию экворина.

Химическая характеристика экворина указывает на то, что белок в некоторой степени устойчив к суровым воздействиям. Экворин термостойкий. [15] При выдержке при 95 °C в течение 2 минут белок потерял только 25% активности. Денатуранты, такие как 6-М мочевина или 4-М гидрохлорид гуанидина, не разрушали белок.

Генетика

Экворин предположительно закодирован в геноме Aequorea. По крайней мере четыре копии гена были извлечены из животного в виде кДНК . [16] [17] Поскольку геном не секвенирован, неясно, могут ли варианты кДНК отвечать за все изоформы белка. [18]

Механизм действия

Ранние исследования биолюминесценции Aequorea , проведенные Э. Ньютоном Харви, отметили, что биолюминесценция проявляется в виде кольца вокруг колокола и возникает даже в отсутствие воздуха. [19] Это было примечательно, поскольку для большинства реакций биолюминесценции требуется кислород , и это привело к идее, что животные каким-то образом запасают кислород. [20] Позже было обнаружено, что апопротеин может стабильно связывать целентеразин-2-гидропероксид, и для регенерации до этой активной формы экворина необходим кислород. [21] Однако в присутствии ионов кальция белок претерпевает конформационные изменения и превращает свою простетическую группу, целентеразин-2-гидропероксид, в возбужденный целентерамид и CO 2 . [22] Когда возбужденный целентерамид релаксирует в основное состояние, излучается синий свет ( длина волны 465 нм). До того, как целентерамид будет заменен, весь белок все еще флуоресцирует синим цветом. [23] [24] из-за связи между биолюминесценцией и флуоресценцией это свойство в конечном итоге сыграло важную роль в открытии люциферина целентеразина . [25]

Приложения

Поскольку излучаемый свет можно легко обнаружить с помощью люминометра , экворин стал полезным инструментом в молекулярной биологии для измерения внутриклеточных уровней Ca 2+ . [26] Ранняя успешная очистка экворина привела к первым экспериментам по введению белка в ткани живых животных для визуализации физиологического высвобождения кальция в мышечных волокнах ракушки. [27] С тех пор этот белок широко использовался во многих модельных биологических системах , включая рыбок данио , [28] крыс , мышей и культивируемых клеток . [29] [30] [31] [32]

Культивируемые клетки, экспрессирующие ген аэкворина, могут эффективно синтезировать апоэкворин; однако рекомбинантная экспрессия дает только апопротеин . Поэтому необходимо добавить целентеразин в культуральную среду клеток для получения функционального белка и, таким образом, использовать его синее излучение для измерения концентрации Ca 2+ . Целентеразин является гидрофобной молекулой и поэтому легко проникает через стенки клеток растений и грибов , а также через плазматическую мембрану высших эукариот, что делает экворин пригодным в качестве репортера Ca 2+ в растениях, грибах и клетках млекопитающих. [33] [34]

Экворин имеет ряд преимуществ перед другими индикаторами Са 2+ . Поскольку белок имеет большие размеры, он имеет низкую скорость утечки из клеток по сравнению с липофильными красителями, такими как DiI . В нем отсутствуют явления внутриклеточной компартментализации или секвестрации, как это часто наблюдается для красителей, чувствительных к напряжению , и он не нарушает функции клеток или развитие эмбриона. Более того, свет, излучаемый при окислении целентеразина, не зависит от какого-либо оптического возбуждения, поэтому устраняются проблемы автофлуоресценции. [35] Основным ограничением экворина является то, что простетическая группа целентеразина необратимо расходуется для производства света и требует постоянного добавления целентеразина в среду. Такие проблемы привели к разработке других генетически кодируемых датчиков кальция, включая датчик камелеон на основе кальмодулина [36] , разработанный Роджером Циеном , и датчик на основе тропонина TN-XXL , разработанный Оливером Грисбеком. [37]

Маркетинговые и юридические проблемы

Апоэкворин входит в состав препарата «Преваген», который продается компанией Quincy Bioscience как добавка для улучшения памяти. В 2017 году Федеральная торговая комиссия США (FTC) обвинила производителя в ложной рекламе о том, что продукт улучшает память, обеспечивает когнитивные преимущества и «клинически доказано» свою эффективность. [38] По данным Федеральной торговой комиссии, «маркетологи Prevagen охотились на страхах пожилых потребителей, испытывающих возрастную потерю памяти ». Куинси заявил, что будет оспаривать обвинения. [39] [40] [41]

До подачи иска клиническое исследование, проведенное исследователями, нанятыми Quincy Bioscience, «не обнаружило никаких общих преимуществ по сравнению с плацебо для его основных конечных результатов, включая память и познание», в то время как в рекламе компании ошибочно цитировались несколько оспариваемых анализов подгрупп , которые показали небольшие улучшения. [42] [43]

Иск ( Спат и др. против Quincy Bioscience Holding Company, Inc. и др. , дело № 18-cv-12416, Д. Нью-Джерси) был отклонен в окружном суде, но апелляция направлена ​​на отмену иска. было оформлено увольнение. Иск был объединен с другим иском против Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (дело № 17-cv-784, D. NJ), которое было основным иском. [44]

21 февраля 2019 года Апелляционный суд США второго округа постановил, что Федеральная торговая комиссия и штат Нью-Йорк могут подать иск против Quincy Bioscience за ее утверждения о том, что Prevagen может улучшить память. Приказ был вынесен менее чем через две недели после того, как стороны представили дело в коллегии из трех судей округа, где юристы компании признали, что они «не оспаривают тот факт, что если вы посмотрите на всех 211 человек, завершивших исследование, не будет обнаружено статистически значимых результатов». разница". Суд решительно отверг обвинения юристов компании в том, что Федеральная торговая комиссия преследовала свои действия по политическим мотивам. [45] [46]

23 марта 2020 года федеральный мировой судья Окружного суда США Южного округа Флориды представил отчет и рекомендации, подтверждающие общенациональный коллективный иск для класса потребителей, которые приобрели Prevagen в течение предыдущих четырех лет. [47] Суд по делу был назначен на октябрь 2020 года. [47] [48]

По состоянию на 21 сентября 2020 года компания Quincy Bioscience согласилась урегулировать претензии о том, что она искажала информацию о своих продуктах Prevagen как о поддерживающих здоровье мозга и помогающих при потере памяти. По условиям мирового соглашения, соответствующие критериям покупатели, подавшие заявку до 26 октября 2020 года на покупки, совершенные в период с 2007 года по 31 июля 2020 года, могут получить возмещение в размере до 70 долларов США. [49]

Доктор Харриет Холл , пишущая для Science-Based Medicine , отметила, что спонсируемое Куинси исследование (известное как «Исследование памяти Мэдисона») было отрицательным, но компания использовала p-хакинг для получения благоприятных результатов. Она написала, что все упомянутые ими исследования безопасности проводились на крысах, а их утверждение о том, что апоэкворин проникает через гематоэнцефалический барьер, основано исключительно на исследованиях на собаках. [50] Американская ассоциация фармацевтов предупреждает, что апоэкворин «вряд ли будет всасываться в значительной степени; вместо этого он разлагается на аминокислоты». [51]

Рекомендации

  1. ^ аб Шимомура О (1995). «Краткая история экворина». Биол. Бык . 189 (1). Биологический бюллетень: 1–5. дои : 10.2307/1542194. JSTOR  1542194. PMID  7654844.
  2. ^ аб Шимомура О, Джонсон Ф.Х., Сайга Ю. (1962). «Извлечение, очистка и свойства экворина, биолюминесцентного белка из светящегося гидромедузана Aequorea». J Cell Comp Физиол . 59 (3): 223–39. дои : 10.1002/jcp.1030590302. ПМИД  13911999.
  3. ^ Харви EN (1921). «Исследования биолюминесценции. XIII. Люминесценция кишечнополостных». Биологический бюллетень . 41 (5): 280–287. дои : 10.2307/1536528. JSTOR  1536528. S2CID  10826363.
  4. ^ Морин Дж.Г., Гастингс Дж.В. (1971). «Перенос энергии в биолюминесцентной системе». Дж. Селл. Физиол . 77 (3): 313–318. дои : 10.1002/jcp.1040770305. PMID  4397528. S2CID  42494355.
  5. ^ Шимомура О (2005). «Открытие экворина и зеленого флуоресцентного белка». Дж Микроск . 217 (Часть 1): 1–15. дои : 10.1111/j.0022-2720.2005.01441.x. PMID  15655058. S2CID  36316988.
  6. ^ Шимомура О, Джонсон FH (1978). «Перекисный целентеразин, активная группа фотопротеина экворина». ПНАС США . 75 (3): 2611–2615. Бибкод : 1978PNAS...75.2611S. дои : 10.1073/pnas.75.6.2611 . ПМЦ 392612 . ПМИД  275832. 
  7. ^ Шарбонно Х., Уолш К.А., Макканн Р.О., Прендергаст Ф.Г., Кормье М.Дж., Ванаман Т.К. (1985). «Аминокислотная последовательность кальций-зависимого фотопротеина экворина». Биохимия . 24 (24): 6762–6771. дои : 10.1021/bi00345a006. ПМИД  2866797.
  8. ^ Чжоу Ю, Ян В., Кирбергер М., Ли Х.В., Аяласомаяджула Г., Ян Дж.Дж. (2006). «Прогнозирование кальцийсвязывающих белков EF-руки и анализ бактериальных белков EF-руки». Белки . 65 (3): 643–655. дои : 10.1002/prot.21139. PMID  16981205. S2CID  8904181.
  9. ^ Руководитель JF, Иноуе С., Тераниши К., Шимомура О (2000). «Кристаллическая структура фотобелка экворина с разрешением 2,3 Å». Природа . 405 (6784): 372–376. Бибкод : 2000Natur.405..372H. дои : 10.1038/35012659. PMID  10830969. S2CID  4425033.
  10. ^ Шимомура О (1995). «Люминесценция экворина вызывается связыванием двух ионов кальция». Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 211 (2): 359–363. дои : 10.1006/bbrc.1995.1821. ПМИД  7794244.
  11. ^ Шимомура О (1995). «Люминесценция экворина вызывается связыванием двух ионов кальция». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 211 (2): 359–363. дои : 10.1006/bbrc.1995.1821. ПМИД  7794244.
  12. ^ Дэн Л., Высоцкий Е.С., Маркова С.В., Лю З.Дж., Ли Дж., Роуз Дж., Ван BC (2005). «Все три Ca2+-связывающие петли фотопротеинов связывают ионы кальция: кристаллические структуры нагруженных кальцием апоэкворина и апообелина». Белковая наука . 14 (3): 663–675. дои : 10.1110/ps.041142905. ПМК 2279293 . ПМИД  15689515. 
  13. ^ Шимомура О, Иноуе С (1996). «Титрование рекомбинантного экворина хлоридом кальция». Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 221 (1): 77–81. дои : 10.1006/bbrc.1996.0548 . ПМИД  8660347.
  14. ^ Омия Ю, Куроно С, Охаши М, Фаган Т.Ф., Цудзи Ф.И. (1993). «Масс-спектрометрические доказательства наличия дисульфидной связи в регенерации экворина». ФЭБС Летт . 332 (3): 226–228. дои : 10.1016/0014-5793(93)80637-а . ПМИД  8405461.
  15. ^ Иноуе С (2004). «Синий флуоресцентный белок из чувствительного к кальцию фотопротеина экворина представляет собой термостойкий фермент, катализирующий окисление целентеразина». ФЭБС Летт . 577 (1–2): 105–110. дои : 10.1016/j.febslet.2004.09.078 . ПМИД  15527769.
  16. ^ Прашер Д., Макканн Р.О., Кормье М.Дж. (1985). «Клонирование и экспрессия кДНК, кодирующей экворин, биолюминесцентный кальцийсвязывающий белок». Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 126 (3): 1259–68. дои : 10.1016/0006-291X(85)90321-3. ПМИД  2579647.
  17. ^ Иноуе С., Ногучи М., Сакаки Ю., Такаги Ю., Мията Т., Иванага С., Мията Т., Цудзи Ф.И. (1985). «Клонирование и анализ последовательности кДНК люминесцентного белка экворина». Учеб. Натл. акад. наук. США . 82 (10): 3154–58. Бибкод : 1985PNAS...82.3154I. дои : 10.1073/pnas.82.10.3154 . ПМЦ 397733 . ПМИД  3858813. 
  18. ^ Масуда Х, Такенака Ю, Шикамото Ю, Кагава М, Мизуно Х, Цудзи Ф.И. (2003). «Хроматография изоформ рекомбинантного апоаекворина и способ получения экворина». Экспр. белка Пуриф . 31 (2): 181–187. дои : 10.1016/s1046-5928(03)00186-4. ПМИД  14550635.
  19. ^ Харви EN (1926). «Кислород и люминесценция с описанием методов удаления кислорода из клеток и жидкостей». Биологический бюллетень . 51 (2): 89–97. дои : 10.2307/1536540. JSTOR  1536540.
  20. ^ Харви EN (1952). Биолюминесценция . Академическая пресса.
  21. ^ Шимомура О, Джонсон FH (1975). «Регенерация фотобелка экворина». Природа . 256 (5514): 236–238. Бибкод : 1975Natur.256..236S. дои : 10.1038/256236a0. PMID  239351. S2CID  4176627.
  22. ^ Шимомура О, Джонсон Ф.Х., Морис Х (1974). «Механизм люминесцентной внутримолекулярной реакции экворина». Биохимия . 13 (16): 3278–3286. дои : 10.1021/bi00713a016. ПМИД  4152180.
  23. ^ Шимомура О, Джонсон FH (1970). «Связывание кальция, квантовый выход и излучающая молекула в биолюминесценции экворина». Природа . 227 (5265): 1356–1357. Бибкод : 1970Natur.227.1356S. дои : 10.1038/2271356a0. PMID  4393938. S2CID  4284185.
  24. ^ Иноуе С., Сасаки С. (2006). «Синий флуоресцентный белок из чувствительного к кальцию фотопротеина экворина: каталитические свойства окисления целентеразина как оксигеназы». ФЭБС Летт . 580 (8): 1977–1982. дои : 10.1016/j.febslet.2006.02.065 . ПМИД  16545379.
  25. ^ Шимомура О, Джонсон FH (1975). «Химическая природа систем биолюминесценции кишечнополостных». Труды Национальной академии наук . 72 (4): 1546–1549. Бибкод : 1975PNAS...72.1546S. дои : 10.1073/pnas.72.4.1546 . ПМЦ 432574 . ПМИД  236561. 
  26. ^ Шимомура О, Иноуе С, Мусики Б, Киши Ю (1990). «Рекомбинантный экворин и рекомбинантные полусинтетические экворины. Клеточные индикаторы ионов Са2+». Биохим. Дж . 270 (2): 309–312. дои : 10.1042/bj2700309. ПМЦ 1131721 . ПМИД  2400391. 
  27. ^ Риджуэй Э.Б., Эшли CC (1967). «Переходные процессы кальция в отдельных мышечных волокнах». Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 29 (2): 229–234. дои : 10.1016/0006-291x(67)90592-x. ПМИД  4383681.
  28. ^ Чунг С.И., Уэбб С.Е., Мэн А., Миллер А.Л. (2006). «Временная экспрессия апоаекворина у эмбрионов рыбок данио: расширение способности отображать переходные процессы кальция на более поздних стадиях развития». Межд. Дж. Дев. Биол . 50 (6): 561–569. дои : 10.1387/ijdb.062151cc . ПМИД  16741871.
  29. ^ Ремболд СМ, Кендалл Дж. М., Кэмпбелл АК (январь 1997 г.). «Измерение изменений саркоплазматического ретикулума [Ca2+] в хвостовой артерии крысы с помощью целевого апоэкворина, доставляемого аденовирусным вектором». Клеточный кальций . 21 (1): 69–79. дои : 10.1016/s0143-4160(97)90098-1. ПМИД  9056079.
  30. ^ Ямано К., Мори К., Накано Р., Кусуноки М., Иноуэ М., Сато М. (2007). «Идентификация функциональной экспрессии рецептора аденозина А3 в поджелудочной железе с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих апоаекворин медузы». Трансгенный Рез . 16 (4): 429–435. дои : 10.1007/s11248-007-9084-0. PMID  17387626. S2CID  19339429.
  31. ^ Шеу Ю.А., Крика Л.Дж., Притчетт Д.Б. (1993). «Измерение внутриклеточного кальция с использованием биолюминесцентного экворина, экспрессируемого в клетках человека». Анальный. Биохим . 209 (2): 343–347. дои : 10.1006/abio.1993.1132 . ПМИД  8470808.
  32. ^ Митхефер А, Мазар С (2002). «Измерения внутриклеточных сигнатур Ca2+ в растительных клетках с помощью экворина». Биол. Продолж. В сети . 4 : 105–118. дои : 10.1251/bpo40. ПМК 145563 . PMID  12734562. Архивировано из оригинала 28 июля 2005 г. 
  33. ^ Блинкс-младший, Вир В.Г., Хесс П., Прендергаст Ф.Г. (1982). «Измерение концентрации Ca2+ в живых клетках». Прога Биофиз Мол Биол . 40 (1–2): 1–114. дои : 10.1016/0079-6107(82)90011-6 . ПМИД  6758036.
  34. ^ Монтеро М., Брини М., Марсо Р., Альварес Дж., Ситиа Р., Поццан Т., Риццуто Р. (1995). «Мониторинг динамических изменений концентрации свободного Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме интактных клеток». ЭМБО Дж . 14 (22): 5467–5475. doi :10.1002/j.1460-2075.1995.tb00233.x. ПМК 394660 . ПМИД  8521803. 
  35. ^ Кендалл Дж. М., Бадминтон Миннесота, Сала-Ньюби ГБ, Кэмпбелл АК, Ремболд СМ (1996). «Рекомбинантный апоэкворин, действующий как псевдолюцифераза, сообщает о микромолярных изменениях в эндоплазматическом ретикулуме, свободном от Ca2+, интактных клеток». Биохим Дж . 318 (2): 383–387. дои : 10.1042/bj3180383. ПМЦ 1217633 . ПМИД  8809023. 
  36. ^ Мияваки А., Ллопис Дж., Хайм Р., Маккаффери Дж. М., Адамс Дж. А., Икура М., Цьен Р. Ю. (1997). «Флуоресцентные индикаторы Ca2+ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина». Природа . 388 (6645): 882–887. Бибкод : 1997Natur.388..882M. дои : 10.1038/42264 . PMID  9278050. S2CID  13745050.
  37. ^ Хайм Н., Грисбек О (2004). «Генетически закодированные индикаторы динамики клеточного кальция на основе тропонина С и зеленого флуоресцентного белка». J Биол Хим . 279 (14): 14280–14286. дои : 10.1074/jbc.M312751200 . ПМИД  14742421.
  38. ↑ Гамильтон, Марта М. (11 сентября 2021 г.). «Улучшает ли добавка Преваген память? Этот вопрос задается в судебном деле». Вашингтон Пост . Проверено 11 сентября 2021 г.
  39. ↑ Fox M (9 января 2017 г.). «Преваген, добавка для памяти медуз, - это обман, заявляет Федеральная торговая комиссия» . Новости Эн-Би-Си . Проверено 9 января 2017 г.
  40. ↑ Ли Д.К. (9 января 2017 г.). «Шнайдерман в судебном иске назвал Prevagen «явным мошенничеством»». Нью-Йорк Пост . Проверено 9 января 2017 г.
  41. ^ «Заявления Prevagen о подозрительной памяти подверглись критике со стороны федеральных регулирующих органов» . Правда в рекламе . 9 января 2017 года . Проверено 9 января 2017 г.
  42. ^ Школа общественного здравоохранения Калифорнийского университета в Беркли, Здоровье после 50 лет , «Забудьте о белке медузы», зима, 2017–18, стр. 6
  43. ^ «Prevagen: как эта добавка для памяти может провалить одно испытание и при этом рекламироваться как эффективная?» Центр науки в интересах общества . 20 ноября 2017 года . Проверено 20 сентября 2018 г.
  44. ^ «Добавка Prevagen от Quincy Bioscience, октябрь 2018 г.», Truth in Advertising , октябрь 2018 г. Проверено 14 ноября 2018 г.
  45. ^ FTC против Quincy Bioscience Holding Company, Апелляционный суд США второго округа, дело 17-3745, документ 257, 21 февраля 2019 г. Проверено 26 марта 2019 г.
  46. ^ «Преваген идет наперекосяк», Правда в рекламе , 22 февраля 2019 г. Проверено 26 марта 2019 г.
  47. ↑ Аб Мора, Майкл А. (24 марта 2020 г.). «Федеральный мировой судья рекомендует подтвердить общенациональный групповой иск Prevagen во Флориде». Ежедневный обзор бизнеса . Law.com . Проверено 24 марта 2020 г.
  48. ^ «Отчет и рекомендации по ходатайству истца о сертификации класса». Гугл документы . Окружной суд США, Южный округ Флориды, отделение Майами. 19 марта 2020 г. Проверено 24 октября 2020 г.
  49. ^ «Урегулирование коллективного иска о добавке для здоровья мозга Prevagen» . Действия высшего класса . 21 сентября 2020 г.
  50. ↑ Холл, Харриет (4 декабря 2018 г.). «Ридерз Дайджест продвигает Преваген». Научная медицина . Архивировано из оригинала 5 декабря 2018 года . Проверено 5 декабря 2018 г.
  51. ^ Хьюм, Энн. «Апоаекворин для улучшения памяти?». Фармацевт.com. Архивировано из оригинала 5 декабря 2018 года . Проверено 5 декабря 2018 г.

Внешние ссылки