Cas12a ( C RISPR как ассоциированный белок 12a , ранее известный как Cpf1 ) представляет собой подтип белков Cas12 и РНК-ориентируемую эндонуклеазу , которая является частью системы CRISPR у некоторых бактерий и архей . Он возникает как часть бактериального иммунного механизма , где он служит для разрушения генетического материала вирусов и, таким образом, защиты клетки и колонии от вирусной инфекции. Cas12a и другие CRISPR-ассоциированные эндонуклеазы используют РНК (называемую crRNA в случае Cas12a) для нацеливания нуклеиновой кислоты в специфическую и программируемую материю. В организмах, из которых она происходит, эта направляющая РНК представляет собой копию фрагмента чужеродной нуклеиновой кислоты (т.е. фага ), ранее инфицировавшей клетку. [1]
Он представляет интерес для исследователей, поскольку его можно использовать для точечных модификаций ДНК или РНК , аналогично более известной системе CRISPR- Cas9 . [2] Cas12a отличается от Cas9 своим единственным активным сайтом эндонуклеазы RuvC , предпочтением мотива, примыкающего к 5'- протоспейсеру , а также созданием липких, а не тупых концов в месте разреза. Эти и другие различия могут сделать его более подходящим для определенных приложений. Помимо использования в фундаментальных исследованиях , CRISPR-Cas12a может найти применение в лечении генетических заболеваний и реализации генных драйвов . [2]
CRISPR-Cas12a был обнаружен в результате поиска в опубликованной базе данных бактериальных генетических последовательностей многообещающих участков ДНК. Его идентификация с помощью биоинформатики как белка системы CRISPR, его наименование и скрытая марковская модель (HMM) для его обнаружения были представлены в 2012 году в выпуске базы данных семейств белков TIGRFAMs . Cas12a появляется у многих видов бактерий. Последняя эндонуклеаза Cas12a, которая была разработана в качестве инструмента для редактирования генома, была взята у одного из первых 16 видов, которые, как известно, являются ее носителями. [3] Два фермента-кандидата из Acidaminococcus и Lachnospiraceae проявляют эффективную активность по редактированию генома в клетках человека. [2]
Уменьшенная версия Cas9 из бактерии Staphylococcus aureus является потенциальной альтернативой Cas12a. [3]
Системы CRISPR-Cas разделены на два класса: класс 1 использует несколько белков Cas вместе с РНК CRISPR (crRNA) для создания функциональной эндонуклеазы, тогда как системы CRISPR класса 2 используют только один белок Cas с crRNA. Согласно этой классификации Cas12a был идентифицирован как система CRISPR-Cas класса II, типа V, содержащая белок из 1300 аминокислот. [4]
CRISPR ( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ) назван в честь особенностей инвариантных последовательностей ДНК, участвующих в нацеливании . Cas12a первоначально был известен как Cpf1 как аббревиатура CRISPR и двух родов бактерий, в которых он встречается: Prevotella и Francesella . Он был переименован в 2015 году после более широкой рационализации названий белков Cas ( C RISPR как ассоциированных) с целью соответствия их гомологии последовательностей . [4]
Локус Cas12a содержит смешанный альфа / бета- домен, RuvC-I, за которым следует спиральная область, RuvC-II и домен, подобный цинковому пальцу . [5] Белок Cas12a имеет RuvC -подобный эндонуклеазный домен, который аналогичен домену RuvC Cas9. Более того, Cas12a не имеет эндонуклеазного домена HNH, а N-конец Cas12a не имеет альфа-спиральной доли распознавания Cas9. [4]
Архитектура домена Cas12a CRISPR-Cas показывает, что Cas12a функционально уникален и классифицируется как система CRISPR класса 2, типа V. Локусы Cas12a кодируют белки Cas1 , Cas2 и Cas4 , более сходные с системами типа I и III, чем с системами типа II. Поиск в базе данных позволяет предположить наличие белков семейства Cas12a у многих видов бактерий. [4]
Функциональному Cas12a не нужна tracrRNA , поэтому требуется только crRNA. Это приносит пользу редактированию генома, поскольку Cas12a не только меньше Cas9, но также имеет меньшую молекулу sgRNA (примерно вдвое меньше нуклеотидов , чем Cas9). [6]
Комплекс Cas12a-crRNA расщепляет целевую ДНК или РНК путем идентификации мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM) 5'-YTN-3' [7] (где «Y» представляет собой пиримидин [8] , а «N» представляет собой любое азотистое основание ), в отличие от G-rich PAM, на который нацелен Cas9. После идентификации PAM Cas12a вводит двухцепочечный разрыв ДНК, подобный липкому концу, на 4 или 5 выступающих нуклеотидов. [5]
Система CRISPR-Cas12a состоит из фермента Cas12a и направляющей РНК, которая находит и позиционирует комплекс в нужном месте двойной спирали для расщепления целевой ДНК. Активность систем CRISPR-Cas12a имеет три стадии: [3]
Cas9 требуется две молекулы РНК для разрезания ДНК, а Cas12a — одна. Белки также разрезают ДНК в разных местах, предоставляя исследователям больше возможностей при выборе места редактирования. Cas9 разрезает обе цепи молекулы ДНК в одном и том же положении, оставляя после себя тупые концы . Cas12a оставляет одну прядь длиннее другой, создавая липкие концы . Липкие концы обладают свойствами, отличными от тупых концов во время негомологичного соединения концов или гомологичной репарации ДНК, что дает Cas12a определенные преимущества при попытках вставки генов по сравнению с Cas9. [3] Хотя система CRISPR-Cas9 может эффективно отключать гены, вставить гены или создать нокаут сложно. [1] Cas12a не имеет tracrRNA , использует Т-богатый PAM и расщепляет ДНК посредством шахматного DSB ДНК. [6]
Таким образом, важные различия между системами Cas12a и Cas9 заключаются в том, что Cas12a: [10]
Эндонуклеазы Cas12, вероятно, в конечном итоге произошли от эндонуклеазы TnpB транспозонов семейства IS200/IS605. TnpB , еще не «одомашненные» в иммунной системе CRISPR, сами способны выполнять расщепление под контролем РНК с использованием матричной системы OmegaRNA . [11]
При использовании CRISPR на целевую эффективность и специфичность влияют множество аспектов, включая дизайн направляющей РНК. Разработано множество моделей проектирования и программных инструментов CRISPR-Cas для оптимального проектирования направляющей РНК. К ним относятся конструктор SgRNA, CRISPR MultiTargeter, SSFinder. [12] Кроме того, доступны коммерческие антитела для обнаружения белка Cas12a. [13]
CRISPR-Cas9 является предметом споров об интеллектуальной собственности , тогда как CRISPR-Cas12a не имеет тех же проблем. [2]