Eco RI (произносится как «eco R one») представляет собой фермент эндонуклеазу рестрикции , выделенный из вида E. coli . Это фермент рестрикции, который расщепляет двойные спирали ДНК на фрагменты в определенных сайтах, а также является частью системы модификации рестрикции . [1] Часть Eco в названии фермента происходит от вида, из которого он был выделен: «E» обозначает родовое название «Escherichia», а «co» обозначает название вида, «coli», а R представляет конкретный штамм. , в данном случае RY13, а буква I означает, что это был первый фермент, выделенный из этого штамма. [ нужна цитата ]
В молекулярной биологии он используется как фермент рестрикции . Eco RI создает липкие концы из 4 нуклеотидов с 5'-концевыми выступами AATT. Последовательность распознавания нуклеиновой кислоты, которую разрезает фермент, представляет собой G↓AATTC, которая имеет палиндромную комплементарную последовательность CTTAA↓G. [2] Другие ферменты рестрикции, в зависимости от места их разреза, также могут оставлять 3'-выступы или тупые концы без выступов.
EcoRI является примером ферментов рестрикции типа II, которые в настоящее время насчитывают более 300 ферментов с более чем 200 различными специфичностями последовательностей, что изменило молекулярную биологию и медицину . [3]
EcoRI, открытый в 1970 году, был выделен аспирантом Робертом Йошимори, который исследовал клинические изоляты E. coli , содержащие системы рестрикции, представленные на его плазмидах . [3] Очищенные изоляты стали известны как EcoRI, который используется для расщепления G'AATTC. [2]
Eco RI содержит мотив PD..D/EXK в своем активном сайте, как и многие эндонуклеазы рестрикции .
Фермент представляет собой гомодимер субъединицы массой 31 килодальтон, состоящей из одного глобулярного домена α/β-архитектуры. Каждая субъединица содержит петлю, которая выступает из глобулярного домена и при связывании оборачивается вокруг ДНК. [4] [5]
Eco RI был сокристаллизован с последовательностью, которую он обычно разрезает. Этот кристалл был использован для решения структуры комплекса ( 1QPS ). Решенная кристаллическая структура показывает, что субъединицы гомодимера фермента взаимодействуют с ДНК симметрично. [4] В комплексе две α-спирали из каждой субъединицы собираются вместе, образуя пучок из четырех спиралей. [6] На взаимодействующих спиралях находятся остатки Glu144 и Arg145, которые взаимодействуют друг с другом, образуя кольцо перекрестных помех, которое, как полагают, позволяет двум активным сайтам фермента взаимодействовать. [7]
Ферменты рестрикции используются в широком спектре методов молекулярной генетики, включая клонирование , скрининг ДНК и удаление участков ДНК in vitro . Ферменты рестрикции, такие как Eco RI, которые создают липкие концы ДНК, часто используются для разрезания ДНК перед лигированием , поскольку липкие концы делают реакцию лигирования более эффективной. [8] Одним из примеров такого использования является получение рекомбинантной ДНК при соединении донорской и векторной ДНК. [9] Eco RI может демонстрировать неспецифическое разрезание, известное как звездчатая активность , в зависимости от условий, присутствующих в реакции. Условия, которые могут вызвать звездную активность при использовании Eco RI, включают низкую концентрацию соли, высокую концентрацию глицерина, чрезмерное количество фермента, присутствующего в реакции, высокий pH и загрязнение некоторыми органическими растворителями. [10]