FeMoco ( кофактор FeMo ) является основным кофактором нитрогеназы . Нитрогеназа — это фермент, катализирующий превращение молекул атмосферного азота N2 в аммиак ( NH3 ) посредством процесса, известного как фиксация азота . Поскольку он содержит железо и молибден , кофактор называется FeMoco. Его стехиометрия — Fe7MoS9C .
Кофактор FeMo представляет собой кластер с составом Fe 7 MoS 9 C. Этот кластер можно рассматривать как две субъединицы, состоящие из одного кластера Fe 4 S 3 ( сульфид железа (III) ) и одного кластера MoFe 3 S 3. Два кластера связаны тремя сульфидными лигандами и мостиковым атомом углерода. Уникальное железо (Fe) закреплено на белке цистеином . Оно также связано с тремя сульфидами, что приводит к тетраэдрической молекулярной геометрии . Дополнительные шесть центров Fe в кластере связаны каждый с тремя сульфидами. Эти шесть внутренних центров Fe определяют тригонально-призматическое расположение вокруг центрального карбидного центра. Молибден присоединен к трем сульфидам и закреплен на белке имидазольной группой остатка гистидина. С Mo также связан бидентатный гомоцитратный кофактор, что приводит к октаэдрической геометрии. [2] Кристаллографический анализ белка MoFe изначально выявил геометрию и химический состав FeMoco, [3] [4] [5] позже подтвержденный исследованиями тонкой структуры рентгеновского поглощения (EXAFS). [6] Расстояния Fe-S, Fe-Fe и Fe-Mo были определены как 2,32, 2,64 и 2,73 Å соответственно. [6]
Биосинтез FeMoco — сложный процесс, требующий нескольких продуктов гена Nif , в частности, продуктов nifS, nifQ, nifB, nifE, nifN, nifV, nifH, nifD и nifK (выраженных как белки NifS, NifU и т. д.). Предполагается, что сборка FeMoco инициируется NifS и NifU, которые мобилизуют Fe и сульфид в небольшие фрагменты Fe-S. Эти фрагменты переносятся на каркас NifB и организуются в кластер Fe 7 MoS 9 C перед переносом в белок NifEN (кодируемый nifE и nifN) и перестраиваются перед доставкой в белок MoFe. [7] В биосинтезе участвуют несколько других факторов. Например, NifV — это гомоцитратсинтаза , которая поставляет гомоцитрат в FeMoco. NifV, белковый фактор, предположительно участвует в хранении и/или мобилизации Mo. Белок Fe является донором электронов для белка MoFe. Эти биосинтетические факторы были выяснены и охарактеризованы с точными функциями и последовательностью, подтвержденными биохимическими, спектроскопическими и структурными анализами.
Три белка, которые играют непосредственную роль в синтезе M-кластера, это NifH, NifEN и NifB. Белок NifB отвечает за сборку ядра Fe-S кофактора; процесс, который включает сшивание двух кластеров [4Fe-4S]. NifB принадлежит к суперсемейству ферментов SAM (S-аденозил-L-метионин). Во время биосинтеза кофактора FeMo, NifB и его кофактор SAM напрямую участвуют во вставке атома углерода в центр комплекса Fe-S. Эквивалент SAM отдает метильную группу, которая становится интерстициальным карбидом M-кластера. Метильная группа SAM мобилизуется путем радикального удаления H радикалом 5'-дезоксиаденозина (5'-dA·). Предположительно, образуется временный радикал –CH2·, который впоследствии включается в металлический кластер, образуя вид Fe 6 -карбида. Интерстициальный углерод остается связанным с кофактором FeMo после вставки в нитрогеназу, [8] Природа центрального атома в FeMoco как вида углерода была идентифицирована в 2011 году. [5] [9] Подход к идентификации основывался на сочетании 13 C/ 15 N-маркировки и импульсной ЭПР-спектроскопии , а также рентгеновских кристаллографических исследований при полном атомном разрешении. [5] Кроме того, рентгеновская дифрактометрия использовалась для проверки того, что в середине кофактора FeMo находится центральный атом углерода, а рентгеновские эмиссионные спектроскопические исследования показали, что центральным атомом является углерод из-за перехода 2p→1s углерод-железо. [9] Использование рентгеновской кристаллографии показало, что, хотя кофактор FeMo не находится в своей каталитической форме, углерод сохраняет структуру жесткой, что помогает описать реакционную способность нитрогеназы.
Согласно анализу с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса , состояние покоя кофактора FeMo имеет спиновое состояние S=3/2. При восстановлении одним электроном кофактор становится молчащим в ЭПР. Понимание процесса, в котором электрон переносится в белковом аддукте, показывает более точную кинетическую модель кофактора FeMo. [10] Расчеты теории функционала плотности, а также пространственно разрешенное аномальное уточнение дисперсии предположили, что формальная степень окисления - Mo IV -2Fe II -5Fe III -C 4− -H + , но «истинные» степени окисления не были подтверждены экспериментально. [11] [12]
Место присоединения субстрата к комплексу еще предстоит выяснить. Считается, что атомы Fe, ближайшие к интерстициальному углероду, участвуют в активации субстрата, но конечный молибден также является кандидатом на фиксацию азота. [13] Рентгеноструктурные кристаллографические исследования с использованием белка MoFe и оксида углерода (CO), который изоэлектронен диазотному атому, продемонстрировали, что оксид углерода связывается с краем Fe2-Fe6 FeMoco. [14] Дополнительные исследования показали одновременное связывание двух молекул CO с FeMoco, что обеспечивает структурную основу для биологической химии типа Фишера-Тропша . [15] [16] Исследования включения Se в сочетании с рентгеновской кристаллографией с временным разрешением продемонстрировали основные структурные перестройки в структуре FeMoco при событиях связывания субстрата. [17]
Изоляция кофактора FeMo из нитрогеназы осуществляется посредством центробежного осаждения нитрогеназы в белок MoFe и белок Fe. Кофактор FeMo извлекается посредством обработки белка MoFe кислотами. Первая экстракция осуществляется с помощью N ,N-диметилформамида , а вторая — смесью N-метилформамида и Na2HPO4 перед окончательным осаждением центрифугированием. [18]