Клетки эмбриональной почки человека 293 , также часто называемые клетками HEK 293 , HEK-293 , 293 , представляют собой иммортализованную клеточную линию , полученную из клеток HEK, выделенных из плода женского пола в 1970-х годах. [1] [2]
Клеточная линия HEK 293 широко использовалась в исследованиях на протяжении десятилетий благодаря ее надежному и быстрому росту и склонности к трансфекции . Эта клеточная линия используется в биотехнологической промышленности для производства терапевтических белков и вирусов для генной терапии , а также для тестирования безопасности широкого спектра химических веществ.
Клетки HEK 293 были получены в 1973 году путем трансфекции культур нормальных клеток эмбриональных почек человека с расщепленной ДНК аденовируса 5 в лаборатории Алекса ван дер Эба в Лейдене, Нидерланды . Клетки были получены от одного абортированного или выкидышного плода, точное происхождение которого неясно. [3] [2] Клетки культивировали Ван дер Эб; трансдукцию аденовирусом выполнил Фрэнк Грэм , постдокторант лаборатории ван дер Эба. Они были опубликованы в 1977 году после того, как Грэм уехал из Лейдена в Университет Макмастера . [4] Их называют HEK, поскольку они произошли из культур эмбриональных почек человека, а число 293 произошло из-за привычки Грэма нумеровать свои эксперименты; оригинальный клон клеток HEK 293 был получен из его 293-го эксперимента. Грэм выполнил трансфекцию в общей сложности восемь раз, получив всего один клон клеток, который культивировали в течение нескольких месяцев. Предположительно адаптировавшись к тканевой культуре, клетки этого клона развились в относительно стабильную линию HEK 293.
Последующий анализ показал, что трансформация была вызвана вставкой ~4,5 тысяч оснований из левого плеча аденовирусного генома, который стал включенным в хромосому человека 19 . [5]
В течение многих лет предполагалось, что клетки HEK 293 образуются в результате трансформации фибробластических , эндотелиальных или эпителиальных клеток , которые в изобилии присутствуют в почках. Однако первоначальная трансформация аденовируса оказалась неэффективной, что позволяет предположить, что клетка, которая в конечном итоге продуцировала линию HEK 293, могла быть в некотором роде необычной. Грэм и его коллеги предоставили доказательства того, что клетки HEK 293 и другие клеточные линии человека, полученные в результате аденовирусной трансформации клеток эмбриональных почек человека, обладают многими свойствами незрелых нейронов , что позволяет предположить, что аденовирус преимущественно трансформировал клетки нейрональной линии в исходной культуре почек. [6]
Всестороннее исследование геномов и транскриптомов HEK 293 и пяти производных клеточных линий сравнило транскриптом HEK 293 с транскриптомом почек, надпочечников, гипофиза и центральной нервной ткани человека. [7] Структура HEK 293 больше всего напоминала структуру клеток надпочечников, которые обладают множеством нейрональных свойств. Учитывая расположение надпочечника ( « надпочечник» означает «рядом с почкой»), несколько клеток надпочечников вполне могли появиться в культуре, полученной из эмбриональной почки, и могли быть преимущественно трансформированы аденовирусом. Аденовирусы трансформируют клетки нейронального происхождения гораздо эффективнее, чем типичные эпителиальные клетки почек человека. [6] Таким образом, эмбриональная клетка-предшественник надпочечников кажется наиболее вероятной исходной клеткой линии HEK 293. Как следствие, клетки HEK 293 не следует использовать в качестве модели типичных клеток почек in vitro .
Клетки HEK 293 имеют сложный кариотип , имеющий две или более копии каждой хромосомы и модальное число хромосом 64. Они описываются как гипотриплоидные, содержащие менее чем в три раза больше хромосом, чем гаплоидная человеческая гамета. Хромосомные аномалии включают в общей сложности три копии Х -хромосом и четыре копии хромосомы 17 и хромосомы 22 . [7] [8] Наличие нескольких Х-хромосом и отсутствие каких-либо следов последовательности, полученной из Y-хромосомы , позволяют предположить, что исходный плод был женского пола.
Линия клеток 293T была создана в лаборатории Мишеля Калоса в Стэнфорде путем стабильной трансфекции линии клеток HEK 293 плазмидой, кодирующей термочувствительный мутант большого T-антигена SV40; Первоначально он назывался 293/ tsA1609neo . [9] Первым упоминанием клеточной линии как «293T» может быть ее использование для создания линии пакующих клеток BOSC23 для производства ретровирусных частиц. [10]
Сообщалось о нескольких вариантах HEK 293. [11] [12]
Трансфекция, использованная для создания 293T (с использованием плазмиды pRSV-1609), обеспечивала устойчивость к неомицину / G418 и экспрессию аллели tsA1609 большого T-антигена SV40; этот аллель полностью активен при 33 °C (его допустимая температура ), выполняет значительную функцию при 37 °C и неактивен при 40 °C. [14] 293T очень эффективно трансфицируется ДНК (как и его родительский HEK 293). Из-за экспрессии большого Т-антигена SV40 трансфицированные плазмидные ДНК, несущие точку начала репликации SV40 , могут реплицироваться в 293T и временно сохранять большое количество копий; это может значительно увеличить количество рекомбинантного белка или ретровируса, которое может быть получено из клеток.
Были определены полные последовательности генома трех различных изолятов 293Т. Они очень похожи друг на друга, но обнаруживают заметные отличия от родительской клеточной линии HEK 293. [15]
Этот мутантный штамм не экспрессирует равновесный переносчик нуклеозидов ENT1. Ген был нокаутирован с помощью CRISPR-CAS9 , и линия клеток сохранила экспрессию ENT2. [16]
Клетки HEK 293 легко выращивать в культуре и трансфицировать. Их использовали в качестве хозяев для экспрессии генов . Обычно эти эксперименты включают трансфекцию интересующего гена (или комбинации генов) и последующий анализ экспрессированного белка . Широкое использование этой клеточной линии обусловлено ее трансфекцией различными методами, в том числе методом фосфата кальция , с достижением эффективности, приближающейся к 100%.
Примеры таких экспериментов включают в себя:
В 1985 году клетки HEK 293 были адаптированы для роста в суспензионной культуре, а не для пролиферации на пластиковых чашках. [22] Это позволило выращивать большие количества рекомбинантных аденовирусных векторов.
Более специфическое использование клеток HEK 293 заключается в размножении аденовирусных векторов . [23] Вирусы предлагают эффективные средства доставки генов в клетки, для чего они и эволюционировали, и поэтому широко используются в качестве экспериментальных инструментов. Однако, будучи патогенами , они также представляют опасность для экспериментатора. Этой опасности можно избежать, используя вирусы, у которых отсутствуют ключевые гены и которые, следовательно, не способны размножаться после проникновения в клетку. Для размножения таких вирусных векторов необходима линия клеток, экспрессирующая недостающие гены. Поскольку клетки HEK 293 экспрессируют ряд аденовирусных генов, их можно использовать для размножения аденовирусных векторов, в которых эти гены (обычно E1 и E3) удалены, например AdEasy. [24] Однако гомологичная рекомбинация между вставленной клеточной последовательностью Ad5 и последовательностью вектора, хотя и редкая, может восстановить репликационную способность вектора. [25]
Важным вариантом этой клеточной линии является клеточная линия 293Т . Он содержит большой Т-антиген SV40 , который обеспечивает эписомальную репликацию трансфицированных плазмид, содержащих точку начала репликации SV40. Это позволяет амплифицировать трансфицированные плазмиды и продлить временную экспрессию желаемых генных продуктов. Клетки HEK 293 и особенно HEK 293T обычно используются для производства различных ретровирусных векторов. [26] На основе этих клеток также созданы различные линии ретровирусных упаковочных клеток.
В зависимости от различных условий экспрессия гена клеток HEK 293 может меняться. Следующие представляющие интерес белки (среди многих других) обычно обнаруживаются в необработанных клетках HEK 293:
Элвин Вонг, католический специалист по биоэтике, утверждает, что, несмотря на неопределенность относительно происхождения эмбриональных клеток, использованных для получения клеточной линии, можно сделать вывод, что она произошла в результате добровольного аборта . Для некоторых это может представлять этическую дилемму при использовании HEK 293 и производных продуктов, таких как вакцины и многие лекарства. [31] [32] [33] [34]
21 декабря 2020 года Римско-католическая Конгрегация доктрины веры заявила, что моральный долг избегать вакцин, изготовленных из клеточных линий, полученных из эмбрионов, «не является обязательным, если существует серьезная опасность, такая как неконтролируемое в противном случае распространение серьезной инфекции». патологическое событие — в данном случае пандемическое распространение вируса SARS-CoV-2, вызывающего Covid-19». Затем заявление оправдывает использование других вакцин: «все прививки, признанные клинически безопасными и эффективными, могут быть использованы с чистой совестью...» [35]
Во время пандемии COVID-19 активисты против вакцинации отметили, что клетки HEK 293 используются при производстве вакцины Oxford-AstraZeneca против COVID-19 (AKA AZD1222). Клетки отфильтровываются из конечных продуктов. [36]
Компания Regeneron Pharmaceuticals , производитель REGN-COV2, терапевтического коктейля антител, используемого для облегчения симптомов пациентов с COVID-19, не использовала клетки HEK 293T для производства коктейля антител, но использовала эти клетки для оценки эффективности препарата. [37] [32]
В ответ на этические проблемы производства вакцин было предложено несколько стратегий, которые врачи могли бы обсудить со своими пациентами. [38]
Несколько месяцев назад я получил электронное письмо от профессора Фрэнка Грэма, создателя этой клеточной линии. Он говорит мне, что, насколько ему известно, точное происхождение фетальных клеток HEK293 неясно. Они могли возникнуть либо в результате самопроизвольного выкидыша, либо в результате планового аборта.
{{cite web}}
: CS1 maint: местоположение ( ссылка )Это то, как вы хотите это анализировать», — говорит Александра Боуи, представитель Regeneron. «Но доступные сегодня клеточные линии 293T не считаются эмбриональной тканью.