Полигистидиновая метка , наиболее известная под торговым названием His-tag , представляет собой аминокислотный мотив в белках , который обычно состоит как минимум из шести остатков гистидина ( His ), часто на N- или C-конце белка. Он также известен как гекса-гистидин-тег , 6xHis-тег или тег His6 . Метка была изобретена компанией Roche [1] , хотя использование гистидинов и их векторов распространяется компанией Qiagen . Различные наборы для очистки белков, меченных гистидином, коммерчески доступны от многих компаний. [2]
Общее количество остатков гистидина может варьироваться в метке от двух до 10 и более остатков His. За N- или C-концевыми His-метками также может следовать или предшествовать им соответственно подходящая аминокислотная последовательность , которая облегчает удаление полигистидиновой метки с помощью эндопептидаз . Эта дополнительная последовательность не является необходимой, если для удаления N-концевых His-меток используются экзопептидазы (например, Qiagen TAGZyme). Кроме того, расщепление экзопептидазой может решить проблему неспецифического расщепления, наблюдаемую при использовании удаления метки на основе эндопротеазы. Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки генетически модифицированных белков.
Белки могут координировать ионы металлов на своей поверхности, и разделить белки можно с помощью хроматографии, используя разницу в их сродстве к ионам металлов. Это называется аффинной хроматографией с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), которая первоначально была введена в 1975 году под названием аффинная хроматография с хелатами металлов. [3] Последующие исследования показали, что среди аминокислот, входящих в состав белков, гистидин активно участвует в координационном комплексе с ионами металлов. [4] Следовательно, если к концу белка добавляется некоторое количество гистидинов, сродство белка к иону металла увеличивается, и это можно использовать для селективного выделения интересующего белка. Когда белок с His-меткой приводится в контакт с носителем, на котором иммобилизован ион металла, такого как никель, остаток гистидина хелатирует ион металла и связывается с носителем. Поскольку другие белки не связываются с носителем или связываются очень слабо, их можно удалить, промыв носитель соответствующим буфером. Белок, меченный полигистидином, затем можно выделить путем элюирования его со смолы. [5]
Полигистидиновые метки чаще всего состоят из шести остатков гистидина. Метки, содержащие до двенадцати остатков гистидина, или двойные метки, прикрепленные через короткий линкер, не являются редкостью и могут улучшить результаты очистки за счет усиления связывания с аффинной смолой, что позволяет повысить строгость промывки и отделения от эндогенных белков. [6] [7] [8] Метку можно добавить к интересующему гену, используя методы, общие для большинства меток очистки . Самый простой метод заключается в субклонировании интересующего гена в вектор, содержащий последовательность полигистидиновой метки. Многие векторы для использования с различными системами экспрессии доступны с полигистидиновыми метками в различных положениях и с разными сайтами протеазного расщепления, другими метками и т.д. [9] Однако, если подходящий вектор недоступен или метку необходимо вставить в место, отличное от N- или C-конца белков, интересующий ген может быть либо напрямую синтезирован, содержащий последовательность полигистидиновой метки, либо различными методами, основанными на ПЦР можно использовать для добавления метки к гену. Распространенный подход заключается в добавлении кодирующей последовательности полигистидиновой метки к праймерам ПЦР в качестве выступающего выступа. [10] [11]
Чаще всего полигистидиновая метка сливается с N-концом или С-концом белка и прикрепляется через короткий гибкий линкер, который может содержать сайт расщепления протеазой. [10] [9] Реже метки могут быть добавлены как на N-, так и на C-концы или вставлены в промежуточную часть белка, например, в открытую петлю. [12] [8] Выбор положения метки зависит от свойств каждого белка и выбранной стратегии очистки; может потребоваться протестировать несколько конструкций с тегом в разных позициях. [6] [10] Хотя считается, что полигистидиновые метки обычно не изменяют свойства белка, было продемонстрировано, что добавление метки может вызвать нежелательные эффекты, такие как влияние на олигомерное состояние белка. [13]
На рынке имеются различные матрицы-носители, связанные с твердой смоляной подложкой, которые впоследствии можно заряжать катионом металла. Для этой цели чаще всего используются производные иминодиуксусной кислоты (ИДК) и нитрилотриуксусной кислоты (НТК) , причем разные матрицы имеют определенные преимущества и недостатки для различных применений. [14]
Катионы некоторых металлов обладают высоким сродством к имидазолу, функциональной группе His-метки. Для этой цели чаще всего используют двухвалентные катионные комплексы переходных металлов M 2+ (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zi и др. ) . Выбор катиона обычно представляет собой компромисс между связывающей способностью и чистотой. Никель часто используется, поскольку он обеспечивает хороший баланс между этими факторами, в то время как кобальт можно использовать, когда желательно повысить чистоту очистки, поскольку он имеет меньшее сродство к эндогенным белкам; однако связывающая способность ниже по сравнению с никелем. [14] [10]
Для элюирования белка, меченного His, с носителя существует несколько потенциальных методов, которые при необходимости можно использовать в комбинации. Чтобы избежать денатурации белков, обычно желательно использовать как можно более мягкий метод.
Для высвобождения His-меченного белка из носителя используют соединение, имеющее структуру, аналогичную His-метке и также образующее координационный комплекс с иммобилизованными ионами металлов. Такое соединение, добавленное к белку, меченному His, на носителе конкурирует с белком за иммобилизованные ионы металлов. Соединение, добавленное в высокой концентрации, заменяет практически весь связанный с носителем белок, который таким образом элюируется с носителя. Имидазол представляет собой боковую цепь гистидина и обычно используется для элюирования в концентрации 150–500 мМ. Также можно использовать гистидин или гистамин.
Когда pH снижается, остаток гистидина протонируется и больше не может координировать металлическую метку, что позволяет белку элюироваться. Когда в качестве иона металла используется никель, он элюируется при pH около 4, а кобальт - при pH около 6.
При добавлении сильного хелатирующего агента, такого как ЭДТА, белок отделяется от носителя, поскольку ион металла, иммобилизованный на носителе, теряется.
Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином, экспрессируемых в Escherichia coli или других системах экспрессии. Обычно клетки собирают центрифугированием и полученный клеточный осадок лизируют либо физическими средствами, либо с помощью детергентов и ферментов , таких как лизоцим, или любой их комбинации. На этом этапе лизат содержит рекомбинантный белок среди многих эндогенных белков, происходящих из клеток-хозяев. Лизат подвергается воздействию аффинной смолы, связанной с матрицей-носителем, связанной с двухвалентным катионом, либо путем прямого добавления смолы (периодическое связывание), либо путем пропускания через слой смолы в формате колонки. Затем смолу промывают буфером для удаления белков, которые специфически не взаимодействуют со связанным катионом, и интересующий белок элюируют со смолы с использованием буфера, содержащего высокую концентрацию имидазола или пониженный pH. Чистоту и количество белка можно оценить такими методами, как SDS-PAGE и вестерн-блоттинг . [14] [10] [15]
Аффинная очистка с использованием полигистидиновой метки обычно приводит к получению относительно чистого белка. Чистоту белка можно повысить добавлением низкой (20-40 мМ) концентрации имидазола к связывающему и/или промывочному буферу. Однако, в зависимости от требований последующего применения, могут потребоваться дальнейшие этапы очистки с использованием таких методов, как ионообменная или эксклюзионная хроматография. Смолы IMAC обычно сохраняют в качестве примесей несколько видных эндогенных белков. Например, в E. coli ярким примером является пептидилпролиизомераза FKBP-типа, которая появляется при массе около 25 кДа на SDS-PAGE . Эти примеси можно удалить с помощью дополнительных стадий очистки или путем экспрессии рекомбинантного белка в дефицитном штамме клеток. Альтернативно можно использовать смолы IMAC с кобальтом, которые имеют меньшее сродство к эндогенным белкам. [16] [10] [14] [17]
Метка полигистидином может использоваться для обнаружения белок-белковых взаимодействий таким же образом, как и анализ с понижением уровня . Метка полигистидином имеет несколько преимуществ перед другими метками, обычно используемыми для анализов с понижением уровня, включая небольшой размер, небольшое количество встречающихся в природе белков, связывающихся с матрицами-носителями, и повышенную стабильность матрицы-носителя по сравнению с матрицами моноклональных антител. [18]
Были разработаны гексахистадиновые метки CyDye, в которых используется ковалентная ковалентная координация никеля с группами ЭДТА, прикрепленными к флуорофорам, для создания красителей, которые прикрепляются к полигистидиновой метке. Было показано, что этот метод полезен для отслеживания миграции и перемещения белков и может быть эффективен для измерения расстояния посредством резонансной передачи энергии Фёрстера . [19]
Сообщалось, что полифторгистидиновая метка может использоваться в системах трансляции in vitro . [20] В этой системе используется расширенный генетический код , в котором гистидин заменен на 4-фторгистидин. Фторированный аналог включается в пептиды за счет ослабленной субстратной специфичности лигазы гистидин-тРНК и снижает общую рК а метки. Это позволяет избирательно обогащать пептиды, меченные полифторгистидином, в присутствии сложных смесей традиционных полигистидиновых меток путем изменения pH промывочных буферов. [ нужна цитата ]
Полигистидиновую метку также можно использовать для обнаружения белка с помощью антител против полигистидиновой метки , что может быть полезно для субклеточной локализации , ELISA , вестерн-блоттинга и других иммуноаналитических методов. Альтернативно, для обнаружения белка, меченного полигистидином, можно использовать внутригельное окрашивание гелей SDS-PAGE или нативного PAGE флуоресцентными зондами, несущими ионы металлов. [21]
Метка HQ содержит чередующиеся гистидин и глутамин (HQHQHQ).
Метка HN содержит чередующиеся гистидин и аспарагин (HNHNHNHNHNHN) и с большей вероятностью будет представлена на поверхности белка, чем метки, содержащие только гистидин. Метка HN связывается с иммобилизованным ионом металла более эффективно, чем метка His. [22]
Метка HAT представляет собой пептидную метку (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK), полученную из лактатдегидрогеназы курицы , и, скорее всего, представляет собой растворимый белок без смещения в распределении заряда по сравнению с меткой His. [23] Расположение гистидинов в метке HAT обеспечивает более высокую доступность по сравнению с меткой His и эффективно связывается с иммобилизованным ионом металла.