Белковая метка

Искусственный пептид, присоединенный к белку для маркировки

Белковые метки — это пептидные последовательности, генетически привитые к рекомбинантному белку . Метки прикрепляются к белкам для различных целей. Их можно добавлять к любому концу целевого белка, поэтому они либо специфичны для C-конца, либо для N-конца , либо специфичны как для C-конца, так и для N-конца. Некоторые метки также вставляются в участки внутри интересующего белка; они известны как внутренние метки. ^[1]

Теги аффинности присоединяются к белкам, чтобы их можно было очистить от их сырого биологического источника с помощью метода аффинности. Теги аффинности включают хитин-связывающий белок (CBP), мальтозо-связывающий белок (MBP), Strep-тег ^[2] и глутатион-S-трансферазу (GST). Тег поли(His) является широко используемым белковым тегом, который связывается с матрицами, содержащими иммобилизованные ионы металлов.

Теги солюбилизации используются, особенно для рекомбинантных белков, экспрессируемых в таких видах, как E. coli , для содействия правильному сворачиванию белков и предотвращения их агрегации в тельцах включения . Эти теги включают тиоредоксин (TRX) и поли(NANP). Некоторые теги сродства играют двойную роль в качестве агента солюбилизации, например MBP и GST.

Хроматографические метки используются для изменения хроматографических свойств белка, чтобы обеспечить различное разрешение в рамках определенной техники разделения. Часто они состоят из полианионных аминокислот, таких как FLAG-метка или полиглутаматная метка. ^[3]

Эпитопные метки — это короткие пептидные последовательности, которые выбираются, поскольку высокоаффинные антитела могут надежно вырабатываться во многих различных видах. Обычно они происходят от вирусных генов, что объясняет их высокую иммунореактивность. Эпитопные метки включают ALFA-тег, V5-тег, Myc-тег , HA-тег , Spot-тег , T7-тег и NE-тег . Эти метки особенно полезны для вестерн-блоттинга , иммунофлуоресценции и экспериментов по иммунопреципитации , хотя они также находят применение в очистке антител.

Флуоресцентные метки используются для визуального считывания белка. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты являются наиболее часто используемыми флуоресцентными метками. ^[4] Более продвинутые приложения GFP включают его использование в качестве репортера фолдинга (флуоресцентный, если сложен, бесцветный, если нет).

Белковые метки могут допускать специфическую ферментативную модификацию (например, биотинилирование биотинлигазой) или химическую модификацию (например, связывание с другими белками через SpyCatcher или реакцию с FlAsH-EDT2 для флуоресцентной визуализации). Часто метки объединяются, чтобы соединить белки с несколькими другими компонентами. Однако с добавлением каждой метки возникает риск того, что нативная функция белка может быть нарушена взаимодействием с меткой. Поэтому после очистки метки иногда удаляются с помощью специфического протеолиза (например, с помощью протеазы TEV , тромбина , фактора Xa или энтеропептидазы ) или сплайсинга интеина .

Список белковых тегов

(См. Протеиногенные аминокислоты#Химические свойства для кодов аминокислот AZ)

Пептидные метки

• ALFA-tag, de novo разработанная спиральная пептидная метка (SRLEEELRRRLTE) для биохимических и микроскопических приложений. Метка распознается репертуаром однодоменных антител ^[5]
• AviTag, пептид, позволяющий биотинилировать фермент BirA, и поэтому белок может быть выделен стрептавидином (GLNDIFEAQKIEWHE)
• C-тег, пептид, который связывается с однодоменным антителом верблюда, разработанным с помощью фагового дисплея (EPEA) ^{[6] [7]}
• Кальмодулин-тег, пептид, связанный с белком кальмодулином (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)
• i CapTag™ ( intein Cap ture Tag ), самоудаляющаяся метка на основе пептида (MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIAHN). i CapTag™ контролируется изменением pH (обычно pH от 8,5 до 6,2). Поэтому эта технология может быть адаптирована к широкому диапазону буферов, отрегулированных до целевых значений pH от 8,5 до 6,2. Ожидаемая чистота целевых белков или пептидов составляет 95-99%. i CapTag™ содержит запатентованный компонент, полученный из интеина Nostoc punctiforme (Npu) . Эта метка используется для очистки белка рекомбинантных белков и его фрагментов. Ее можно использовать в исследовательских лабораториях, а также она предназначена для крупномасштабной очистки в ходе последующего производственного процесса. Комплекс i CapTag™-target protein может быть выражен в широком диапазоне экспрессирующих хозяев ( например, клетки CHO и E.coli ). Он не предназначен для полностью экспрессируемых mAbs ^{[8] [9] [10]}
• полиглутаматная метка, пептид, эффективно связывающийся с анионообменной смолой, такой как Mono-Q (EEEEEE) ^[3]
• полиаргининовая метка, пептид, эффективно связывающийся с катионообменной смолой (от 5 до 9 последовательных R)
• E-тег, пептид, распознаваемый антителом (GAPVPYPDPLEPR)
• FLAG-тег , пептид, распознаваемый антителом (DYKDDDDK) ^[11]
• HA-тег , пептид из гемагглютинина, распознаваемый антителом (YPYDVPDYA) ^[12]
• His-tag , 5-10 гистидинов, связанных хелатом никеля или кобальта (HHHHHH)
  • Gly-His-теги представляют собой варианты N-концевых His-тегов (например, GHHHH или GHHHHHH или GSSHHHHHH), которые по-прежнему связываются с иммобилизованными катионами металлов, но также могут быть активированы посредством азидоглюконоилирования для обеспечения возможности применения клик-химии ^[13]
• Myc-tag , пептид, полученный из c- myc , распознаваемый антителом (EQKLISEEDL)
• NE-tag , синтетический пептид из 18 аминокислот (TKENPRSNQEESYDDNES), распознаваемый моноклональным антителом IgG1, который полезен в широком спектре приложений, включая вестерн-блоттинг, ИФА, проточную цитометрию, иммуноцитохимию, иммунопреципитацию и аффинную очистку рекомбинантных белков ^[14]
• Rho1D4-тег относится к последним 9 аминокислотам внутриклеточного C-конца бычьего родопсина (TETSQVAPA). Это очень специфичный тег, который может быть использован для очистки мембранных белков .
• S-тег , пептид, полученный из рибонуклеазы А (KETAAAKFERQHMDS)
• SBP-тег , пептид, который связывается со стрептавидином (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) ^[15]
• Softag 1, для экспрессии млекопитающих (SLAELLNAGLGGS)
• Softag 3, для прокариотической экспрессии (TQDPSRVG)
• Spot-tag , пептид, распознаваемый нанотелом ( PDRVRAVSHWSS) для иммунопреципитации, аффинной очистки, иммунофлуоресценции и микроскопии сверхвысокого разрешения
• Strep-tag , пептид, который связывается со стрептавидином или модифицированным стрептавидином, называемым стрептактином (Strep-tag II: WSHPQFEK) ^[2]
• T7-tag, эпитопная метка, полученная из основного капсидного белка T7 гена T7 (MASMTGGQQMG). Используется в различных иммуноанализах, а также для аффинной очистки. Используется в основном ^[16]
• Тег TC , тетрацистеиновый тег, который распознается бимышьяковыми соединениями FlAsH и ReAsH (CCPGCC)
• Тег Ty (EVHTNQDPLD)
• Тег V5, пептид, распознаваемый антителом (GKPIPNPLLGLDST) ^[17]
• VSV-tag, пептид, распознаваемый антителом (YTDIEMNRLGK)
• Xpress tag (DLYDDDDK), пептид, распознаваемый антителом

Ковалентные пептидные метки

• Изопептаг , пептид, который ковалентно связывается с белком пилин-С (TDKDMTITFTNKKDAE) ^[18]
• SpyTag , пептид, который ковалентно связывается с белком SpyCatcher (AHIVMVDAYKPTK) ^[19]
• SnoopTag, пептид, который ковалентно связывается с белком SnoopCatcher (KLGDIEFIKVNK). ^[20] Второе поколение, SnoopTagJr, также было разработано для связывания с SnoopCatcher или DogTag (опосредованно SnoopLigase) (KLGSIEFIKVNK) ^[21]
• DogTag, пептид, который ковалентно связывается с DogCatcher (DIPATYEFTDGKHYITNEPIPPK) ^[22] , а также может ковалентно связываться с SnoopTagJr, опосредованно SnoopLigase ^[21]
• SdyTag, пептид, который ковалентно связывается с белком SdyCatcher (DPIVMIDNDKPIT). ^[23] SdyTag/SdyCatcher имеет кинетически-зависимую перекрестную реактивность со SpyTag/SpyCatcher.

Белковые теги

• BCCP (биотинкарбоксильный переносчик белка), домен белка, биотинилированный BirA, обеспечивающий распознавание стрептавидином
• BromoTag, мутировавшая версия второго бромодомена Brd4, Brd4-BD2 L387A, которая может быть высокоселективно связана с тег-специфическим деградатором PROTAC AGB1, образуя тройной комплекс между белком «BromoTagged» и лигазой E3 VHL, что приводит к убиквитинированию меченого белка и его последующей быстрой и эффективной протеасомной деградации в клетках. ^[24]
• FAST (метка, активирующая флуоресценцию и смещающая поглощение), мутировавший фотоактивный желтый белок (PYP), который обратимо связывает родственные флуорогенные лиганды
• CL7-tag, сконструированный вариант колицина E7, обладающий сильным связывающим сродством и специфичностью к иммобилизованному иммунологическому белку 7 (Im7). ^[25]
• Глутатион-S-трансфераза - тег, белок, который связывается с иммобилизованным глутатионом
• Зеленый флуоресцентный белок - тег ^[4] - белок, который спонтанно флуоресцирует и может быть связан с нанотелами.
• HaloTag — мутировавшая бактериальная галоалкандегалогеназа , которая ковалентно присоединяется к галоалкановым субстратам.
• SNAP-tag , мутировавшая эукариотическая ДНК-метилтрансфераза , которая ковалентно присоединяется к производным бензилгуанина
• CLIP-tag , мутировавшая эукариотическая ДНК-метилтрансфераза , которая ковалентно присоединяется к производным бензилцитозина
• HUH-tag , специфичный для последовательности одноцепочечный ДНК-связывающий белок, который ковалентно связывается с целевой последовательностью
• Мальтозосвязывающий белок -tag, белок, который связывается с амилозой агарозой ^[26]
• Nus-тег
• Тиоредоксин -тег
• Fc -тег, полученный из домена Fc иммуноглобулина, позволяет димеризацию и солюбилизацию. Может использоваться для очистки на Protein-A Sepharose
• Разработаны метки с внутренним расстройством, содержащие аминокислоты, способствующие расстройству (P,E,S,T,A,Q,G,..) ^[27]
• Домен распознавания углеводов или CRDSAT-тег, белок, который связывается с лактозой, агарозой или сефарозой ^[28]

Другие

HiBiT-тег был разработан учеными Promega . Это пептидный тег из 11 аминокислот, который может быть слит с N- или C-концом или внутренними участками белков. ^[29] Его небольшой размер приводит к быстрому сшиванию этого тега с другими белками с помощью технологии CRISPR/Cas9. ^[29]

Приложения

• Аффинная очистка
• Массив белков
• Маркировка белков TimeSTAMP
• вестерн-блоттинг

Ссылки

1. Махмуди Гомари, Мохаммад; Сарайгорд-Афшари, Неда; Фарсимадан, Марзие; Ростами, Неда; Агхамири, Шахин; Фараджоллахи, Мохаммад М. (декабрь 2020 г.). «Возможности и проблемы методов очистки белков с помощью тегов: применение в фармацевтической промышленности». Biotechnology Advances . 45 : 107653. doi : 10.1016/j.biotechadv.2020.107653. ISSN  0734-9750. PMID  33157154. S2CID  226276355.
2. Schmidt, Thomas GM; Koepke, Jürgen; Frank, Ronald; Skerra, Arne (1996). «Молекулярное взаимодействие между аффинным пептидом Strep-tag и его родственной мишенью, стрептавидином». Журнал молекулярной биологии . 255 (5): 753–66. doi :10.1006/jmbi.1996.0061. PMID  8636976.
3. Fairhead M, Krndija D, Lowe ED, Howarth M (январь 2014 г.). «Спаривание Plug-and-play через определенные двухвалентные стрептавидины». Журнал молекулярной биологии . 426 (1): 199–214. doi :10.1016/j.jmb.2013.09.016. PMC 4047826. PMID  24056174 . 
4. Чжан, Цзинь; Кэмпбелл, Роберт; Тин, Элис; Циен, Роджер (2002). «Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии». Nat Rev Mol Cell Biol . 3 (12): 906–918. doi :10.1038/nrm976. PMID  12461557. S2CID  11588100.
5. Гетцке, Хансйорг; Килиш, Маркус; Мартинес-Карранса, Маркель; Сограте-Идрисси, Шама; Раджавель, Абирами; Шлихтаерле, Томас; Энгельс, Никлас; Юнгманн, Ральф; Стенмарк, Пол; Опазо, Фелипе; Фрей, Штеффен (2019). «ALFA-tag — это универсальный инструмент для бионаучных приложений на основе нанотел». Природные коммуникации . 10 (1): 4403. Бибкод : 2019NatCo..10.4403G. дои : 10.1038/s41467-019-12301-7. ПМК 6764986 . ПМИД  31562305. 
6. Де Генст, Эрвин Дж.; Гильямс, Тим; Велленс, Шутка; О'Дей, Элизабет М.; Воудби, Кристофер А.; Михан, Сара; Дюмулен, Мирей; Сюй, Шан-Те Дэнни; Кремадес, Нунило; Вершуерен, Коэн Х.Г.; Простите, Элс; Винс, Лод; Стейерт, Ян; Христодулу, Джон; Добсон, Кристофер М. (сентябрь 2010 г.). «Структура и свойства комплекса α-синуклеина и однодоменного антитела верблюда» (PDF) . Журнал молекулярной биологии . 402 (2): 326–343. дои : 10.1016/j.jmb.2010.07.001. ПМИД  20620148.
7. "Матрица аффинности CaptureSelect C-tag - Thermo Fisher Scientific". www.thermofisher.com .
8. Купер, Меридет А.; Тарис, Джозеф Э.; Ши, Чанхуа; Вуд, Дэвид В. (2018). «Удобный метод расщепления интеина для очистки целевых белков без тегов». Current Protocols in Protein Science . 91 (1): 5.29.1–5.29.23. doi :10.1002/cpps.46. ISSN  1934-3655. PMID  29516483. S2CID  3749506.
9. Prabhala, Sai Vivek; Gierach, Izabela; Wood, David W. (2022). «Эволюция методов аффинности на основе интеина, отраженная в 30-летней истории патентования». Frontiers in Molecular Biosciences . 9 : 857566. doi : 10.3389/fmolb.2022.857566 . ISSN  2296-889X. PMC 9033041. PMID 35463948  . 
10. «Технология iCapTag™ — наука о захвате белков». www.proteincapturescience.com .
11. Эйнхауэр, А.; Юнгбауэр, А. (2001). «Пептид FLAG™, универсальная метка слияния для очистки рекомбинантных белков». Журнал биохимических и биофизических методов . 49 (1–3): 455–65. doi :10.1016/S0165-022X(01)00213-5. PMID  11694294.
12. Prakriya, Murali; Feske, Stefan; Gwack, Yousang; Srikanth, Sonal; Rao, Anjana; Hogan, Patrick G. (2006). "Orai1 является неотъемлемой субъединицей поры канала CRAC". Nature . 443 (7108): 230–3. Bibcode :2006Natur.443..230P. doi :10.1038/nature05122. PMID  16921383. S2CID  4310221.
13. Брюн, Карл Д.; Лиекниня, Ильва; Сутов, Григорий; Моррис, Александр Р.; Йовичевич, Деяна; Калниньш, Гинтс; Казакс, Андрис; Клуга, Рихардс; Касталяна, Сабина; Заякина, Анна; Янсонс, Юрис; Скрастиня, Даце; Спунде, Карина; Коэн, Александр А.; Бьоркман, Памела Дж.; Моррис, Ховард Р.; Суна, Эдгарс; Тарс, Каспарс (16 ноября 2021 г.). «N-концевая модификация Gly-His-меченных белков азидоглюконолактоном». ХимБиоХим . 22 (22): 3199–3207. дои : 10.1002/cbic.202100381. ISSN  1439-7633. PMID  34520613. S2CID  237515136.
14. Ho, Philip WL.; Tse, Zero HM.; Liu, HF.; Lu, S.; Ho, Jessica WM.; Kung, Michelle HW.; Ramsden, David B.; Ho, SL. (2013). «Оценка клеточной эстрогенной активности на основе опосредованного рецептором эстрогена снижения экспрессии растворимой формы катехол-O-метилтрансферазы (COMT) в системе на основе ELISA». PLOS ONE . ​​8 (9): e74065. Bibcode :2013PLoSO...874065H. doi : 10.1371/journal.pone.0074065 . PMC 3765251 . PMID  24040167. 
15. Keefe, Anthony D.; Wilson, David S.; Seelig, Burckhard; Szostak, Jack W. (2001). «Одношаговая очистка рекомбинантных белков с использованием наномолярного аффинного пептида, связывающего стрептавидин, SBP-Tag». Protein Expression and Purification . 23 (3): 440–6. doi :10.1006/prep.2001.1515. PMID  11722181.
16. «Эпитопные метки и белки слияния – антитела-онлайн». www.antibodies-online.com .
17. МакНатт, Марки К.; Лагас, Томас А.; Хортон, Джей Д. (2007). «Каталитическая активность не требуется для секретируемого PCSK9 для снижения рецепторов липопротеинов низкой плотности в клетках HepG2». Журнал биологической химии . 282 (29): 20799–803. doi : 10.1074/jbc.C700095200 . PMID  17537735.
18. Закери, Биджан; Ховарт, Марк (2010). «Спонтанное образование межмолекулярной амидной связи между боковыми цепями для необратимого нацеливания пептидов». Журнал Американского химического общества . 132 (13): 4526–7. doi :10.1021/ja910795a. PMID  20235501.
19. Закери, Биджан; Фирер, Джейкоб О.; Селик, Эмрах; Читток, Эмили К.; Шварц-Линек, Ульрих; Мой, Винсент Т.; Ховарт, Марк (2012). «Пептидная метка, формирующая быструю ковалентную связь с белком посредством конструирования бактериального адгезина». Труды Национальной академии наук . 109 (12): E690–7. Bibcode : 2012PNAS..109E.690Z. doi : 10.1073/pnas.1115485109 . PMC 3311370. PMID  22366317 . 
20. Veggiani, Gianluca; Nakamura, Tomohiko; Brenner, Michael; Gayet, Raphael; Yan, Jun; Robinson, Carol; Howarth, Mark (2016). «Программируемые полипротеамы, построенные с использованием двух пептидных суперклеев». Труды Национальной академии наук . 113 (5): 1202–7. Bibcode : 2016PNAS..113.1202V. doi : 10.1073/pnas.1519214113 . PMC 4747704. PMID  26787909 . 
21. Buldun, Can M.; Jean, Jisoo X.; Bedford, Michael R.; Howarth, Mark (14 февраля 2018 г.). «SnoopLigase катализирует пептид-пептидную блокировку и обеспечивает твердофазную конъюгатную изоляцию». Журнал Американского химического общества . 140 (8): 3008–3018. doi :10.1021/jacs.7b13237. PMID  29402082. S2CID  207189163.
22. Keeble, Anthony H.; Yadav, Vikash K.; Ferla, Matteo P.; Bauer, Claudia C.; Chuntharpursat-Bon, Eulashini; Huang, Jin; Bon, Robin S.; Howarth, Mark (июль 2021 г.). «DogCatcher позволяет осуществлять петлево-дружественное лигирование белок-белок». Cell Chemical Biology . 29 (2): 339–350.e10. doi : 10.1016/j.chembiol.2021.07.005 . ISSN  2451-9456. PMC 8878318 . PMID  34324879. 
23. Тан, Ли Линг; Хун, Шон С.; Вонг, Фонг Т.; Ахмед, С. Ашраф (26 октября 2016 г.). «Кинетически контролируемые взаимодействия тегов и ловцов для направленной ковалентной сборки белков». PLOS ONE . 11 (10): e0165074. Bibcode : 2016PLoSO..1165074T. doi : 10.1371/journal.pone.0165074 . PMC 5082641. PMID  27783674 . 
24. Ciulli, Bond; Alessi, Craigon (октябрь 2021 г.). «Разработка BromoTag: система «Bump-and-Hole»–PROTAC для индукции мощной, быстрой и селективной деградации меченых целевых белков». J Med Chem . 64 (20): 15477–15502. doi : 10.1021/acs.jmedchem.1c01532 . PMC 8558867. PMID  34652918 . 
25. Chow, Louise T.; Vassylyev, Dmitry G. (2022). «Применение новой системы аффинности CL7/Im7 в очистке сложных и фармацевтических белков». Аффинная хроматография . Методы в молекулярной биологии. Т. 2466. С. 61–82. doi :10.1007/978-1-0716-2176-9_5. ISBN 978-1-0716-2175-2. PMID  35585311.
26. Бедуэль, Хьюз; Дюплей, Паскаль (февраль 1988 г.). «Производство в Escherichia coli и одношаговая очистка бифункциональных гибридных белков, связывающих мальтозу. Экспорт полимеразы Кленова в периплазматическое пространство». Eur J Biochem . 171 (3): 541–549. doi : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x . PMID  3278900.
27. Minde, David P; Halff, Els F; Tans, Sander (2013). «Проектирование беспорядка: Истории о неожиданных хвостах». Внутренне неупорядоченные белки . 1 (1): 5–15. doi :10.4161/idp.26790. PMC 5424805. PMID  28516025 . 
28. Кризник, Александр; Йелехе-Окума, Мелисса; Лек, Жан-Кристоф; Грошенри, Гийом; Ле Кордье, Элен; Чаррон, Кристоф; Кинтернет, Марк; Мазон, Гортензия; Тальфурнье, Франсуа; Боски-Мюллер, Сандрин; Жузо, Жан-Ив; Ребул, Паскаль (октябрь 2018 г.). «CRDSAT, созданный pCARGHO: новый эффективный метод аффинной метки на основе лектина для безопасной, простой и недорогой очистки белка». Биотехнологий Дж . 14 (4): 1800214. doi :10.1002/biot.201800214. PMID  30298550. S2CID  52942568.
29. Schwinn, Marie K.; Machleidt, Thomas; Zimmerman, Kris; Eggers, Christopher T.; Dixon, Andrew S.; Hurst, Robin; Hall, Mary P.; Encell, Lance P.; Binkowski, Brock F.; Wood, Keith V. (16.02.2018). "CRISPR-опосредованное маркирование эндогенных белков люминесцентным пептидом". ACS Chemical Biology . 13 (2): 467–474. doi : 10.1021/acschembio.7b00549 . ISSN  1554-8929. PMID  28892606.