Система Strep-tag — это метод, позволяющий очищать и обнаруживать белки с помощью аффинной хроматографии . Strep-tag II — это синтетический пептид, состоящий из восьми аминокислот ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Эта пептидная последовательность проявляет внутреннее сродство к Strep-Tactin, специально разработанному стрептавидину , и может быть слита с N- или C-концом с рекомбинантными белками. Используя высокоспецифичное взаимодействие, белки, помеченные Strep , могут быть выделены за один шаг из сырых клеточных лизатов. Поскольку Strep -tag элюируется в мягких физиологических условиях, он особенно подходит для получения функциональных белков. [1] [2]
Strep-tag, Twin-Strep-tag и Strep-Tactin являются зарегистрированными товарными знаками IBA Lifesciences GmbH .
Стрептавидин — это тетрамерный белок, экспрессируемый в Streptomyces avidinii . Благодаря высокому сродству стрептавидина к витамину H ( биотину ), стрептавидин широко используется в областях молекулярной биологии и биотехнологии . Strep-tag изначально был выбран из генетической библиотеки для специфического связывания с протеолитически укороченной «основной» версией стрептавидина. С годами Strep-tag был системно оптимизирован, чтобы обеспечить большую гибкость в выборе места прикрепления. Кроме того, его партнер по взаимодействию, стрептавидин, также был оптимизирован для увеличения способности связывания пептидов, что привело к разработке Strep-Tactin. Сродство связывания Strep-tag со Strep-Tactin почти в 100 раз выше, чем у Strep-tag со стрептавидином. Так называемая система Strep-tag, состоящая из Strep-tag и Strep-Tactin, оказалась особенно полезной для функциональной изоляции и анализа белковых комплексов в исследованиях протеома . [3]
Как и другие метки с коротким сродством ( His-tag , FLAG-tag ), Strep-tag может быть легко слит с рекомбинантными белками во время субклонирования его кДНК или гена . Для его экспрессии доступны различные векторы для различных организмов-хозяев ( E. coli , дрожжи , насекомые и клетки млекопитающих ). [4] Особым преимуществом Strep-tag является его довольно небольшой размер и тот факт, что он биохимически почти инертен . Поэтому сворачивание или секреция белка не подвергается влиянию и обычно не мешает функции белка. Strep-tag особенно подходит для анализа функциональных белков, поскольку процедура очистки может проводиться в физиологических условиях. Это позволяет не только изолировать чувствительные белки в нативном состоянии, но также возможно очищать интактные белковые комплексы, [5] даже если только одна субъединица несет метку.
На первом этапе цикла очистки Strep-tag клеточный лизат , содержащий белок слияния Strep-tag, наносится на колонку с иммобилизованным Strep-Tactin (этап 1). После того, как меченый белок специфически связался со Strep-Tactin, короткий этап промывки физиологическим буфером ( например, фосфатным буферным раствором, PBS) удаляет все остальные белки хозяина (этап 2). Это связано с низкой тенденцией Strep-Tactin связывать белки неспецифично. Затем очищенный белок слияния Strep-tag осторожно элюируется низкой концентрацией дестиобиотина, который специфически конкурирует за карман связывания биотина (этап 3). Для регенерации колонки дестиобиотин удаляется путем нанесения раствора, содержащего HABA (желтый азокраситель ). Удаление дестиобиотина обозначается изменением цвета с желто-оранжевого на красный (этап 4+5). Наконец, раствор HABA промывается небольшим объемом рабочего буфера, что делает колонку готовой к использованию для следующего цикла очистки.
Система Strep-tag предлагает селективный инструмент для очистки белков в физиологических условиях. Полученные белки биоактивны и демонстрируют очень высокую чистоту (более 95%). Кроме того, система Strep-tag может использоваться для обнаружения белков в различных анализах. В зависимости от экспериментальных обстоятельств, антитела Strep-tag или Strep-Tactin с ферментативным (например, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (AP)) или флуоресцентным (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP)) маркером. Если требуется высокая чистота, лизат можно очистить сначала с помощью Strep-Tactin, а затем выполнить второй запуск с использованием антител против Strep-tag. Это снижает загрязнение неспецифически связанными белками, которое может иметь место в некоторых редких случаях.
С помощью системы обнаружения Strep-tag можно проводить следующие анализы:
Поскольку Strep-tag способен изолировать белковые комплексы, стратегии для изучения белок-белковых взаимодействий также могут быть реализованы. Другим вариантом является иммобилизация белков Strep-tag с помощью специфического высокоаффинного антитела на микропланшетах или биочипах.
Система Strep-Tag/StrepTactin также используется в экспериментах с одиночными молекулами с помощью оптического пинцета и атомно-силового микроскопа , демонстрируя высокую механическую стабильность, сравнимую с самыми сильными нековалентными связями, доступными в настоящее время. [6]