Иммуноцитохимия ( ICC ) — это распространенный лабораторный метод , который используется для анатомической визуализации локализации определенного белка или антигена в клетках с помощью специфического первичного антитела , которое связывается с ним. Первичное антитело позволяет визуализировать белок под флуоресцентным микроскопом , когда он связывается со вторичным антителом , имеющим конъюгированный флуорофор . ICC позволяет исследователям оценить, экспрессируют ли клетки в конкретном образце рассматриваемый антиген [1] . В случаях обнаружения иммунопозитивного сигнала ICC также позволяет исследователям определить, какие субклеточные компартменты экспрессируют антиген.
Иммуноцитохимия отличается от иммуногистохимии [2] тем, что первая проводится на образцах интактных клеток, у которых удалена большая часть, если не вся, окружающая их внеклеточная матрица . [ нужна цитация ] Сюда входят отдельные клетки, выделенные из блока твердой ткани, клетки, выращенные в культуре , клетки, депонированные из суспензии , или клетки, взятые из мазка . Напротив, иммуногистохимические образцы представляют собой участки биологической ткани , где каждая клетка окружена тканевой архитектурой и другими клетками, обычно встречающимися в неповрежденной ткани. Иммуноцитохимия — это метод, используемый для оценки присутствия определенного белка или антигена в клетках (культивируемых клетках, клеточных суспензиях) с помощью специфического антитела, которое связывается с ним, что позволяет визуализировать и исследовать его под микроскопом. Это ценный инструмент для определения клеточного содержимого отдельных клеток. Образцы, которые можно анализировать, включают мазки крови, аспираты, мазки, культивированные клетки и клеточные суспензии.
Существует множество способов подготовки образцов клеток для иммуноцитохимического анализа. Каждый метод имеет свои сильные стороны и уникальные характеристики, поэтому можно выбрать правильный метод для желаемой выборки и результата.
Клетки, подлежащие окрашиванию, можно прикрепить к твердой подложке, чтобы их можно было легко использовать в последующих процедурах. Этого можно достичь несколькими методами: прикрепившиеся клетки можно выращивать на предметных стеклах микроскопа, покровных стеклах или оптически подходящей пластиковой подложке. Суспензионные клетки можно центрифугировать на предметных стеклах ( цитоспин ), связывать с твердой подложкой с помощью химических линкеров или, в некоторых случаях, хранить в суспензии.
Концентрированные клеточные суспензии, существующие в среде с низкой вязкостью, являются хорошими кандидатами для приготовления мазков. Разбавленные клеточные суспензии, существующие в разбавленной среде, лучше всего подходят для приготовления цитоспинов путем цитоцентрифугирования. Суспензии клеток, существующие в среде с высокой вязкостью, лучше всего подходят для тестирования в виде препаратов тампонов. Неизменным среди этих препаратов является то, что на поверхности предметного стекла присутствует вся клетка. Для того чтобы произошла какая-либо межклеточная реакция, иммуноглобулин должен сначала проникнуть через клеточную мембрану, которая в этих препаратах не повреждена. Реакции, происходящие в ядре, могут быть более сложными, а внеклеточная жидкость может создавать уникальные препятствия для проведения иммуноцитохимии. В этой ситуации становится необходимым пермеабилизация клеток с помощью детергента (Тритон Х-100 или Твин-20) или выбора органических фиксаторов (ацетон, метанол или этанол).
Антитела являются важным инструментом для демонстрации как присутствия, так и субклеточной локализации антигена. Окрашивание клеток — очень универсальный метод, и, если антиген сильно локализован, можно обнаружить всего лишь тысячу молекул антигена в клетке. В некоторых случаях окрашивание клеток также можно использовать для определения приблизительной концентрации антигена, особенно с помощью анализатора изображений.
Существует множество методов иммунологического обнаружения на тканях, в том числе методы, связанные непосредственно с первичными антителами или антисыворотками. Прямой метод включает использование обнаруживаемой метки (например, флуоресцентной молекулы, частиц золота и т. д.) непосредственно к антителу [3] , которому затем позволяют связываться с антигеном (например, белком) в клетке.
Альтернативно, существует множество косвенных методов . В одном из таких методов антиген связывается с первичным антителом, которое затем амплифицируется с использованием вторичного антитела , которое связывается с первичным антителом. Затем наносится третичный реагент, содержащий ферментативную часть, который связывается со вторичным антителом. При нанесении четвертичного реагента или субстрата ферментативный конец третичного реагента превращает субстрат в продукт пигментной реакции, который дает цвет (возможны многие цвета: коричневый, черный, красный и т. д.) в одном и том же цвете. место, где исходное первичное антитело распознало интересующий антиген.
Некоторыми примерами используемых субстратов (также известных как хромогены) являются AEC (3-амино-9-этилкарбазол) или DAB ( 3,3'-диаминобензидин ). Использование одного из этих реагентов после воздействия необходимого фермента (например, пероксидазы хрена, конъюгированной с реагентом антитела) приводит к образованию положительного продукта иммунореакции. Иммуноцитохимическая визуализация конкретных представляющих интерес антигенов может использоваться, когда менее специфическое окрашивание, такое как H&E (гематоксилин и эозин), не может быть использовано для постановки диагноза или для предоставления дополнительной прогностической информации относительно лечения (например, при некоторых видах рака).
Альтернативно вторичное антитело может быть ковалентно связано с флуорофором ( наиболее распространенными являются FITC и родамин ), который обнаруживается с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. Местоположение флуоресценции будет варьироваться в зависимости от молекулы-мишени: внешней для мембранных белков и внутренней для цитоплазматических белков. Таким образом, иммунофлуоресценция в сочетании с конфокальной микроскопией является мощным методом изучения расположения белков и динамических процессов ( экзоцитоза , эндоцитоза и т. д.).