stringtranslate.com

Варианты ПЦР

Универсальность полимеразной цепной реакции (ПЦР) привела к модификациям базового протокола, используемого в большом количестве вариантов методик, разработанных для различных целей. В этой статье суммируются многие из наиболее распространенных вариаций, которые в настоящее время или ранее использовались в лабораториях молекулярной биологии ; знакомство с фундаментальной предпосылкой, по которой работает ПЦР, и соответствующими терминами и концепциями необходимо для понимания этих вариантов методик.

Основные модификации

Зачастую для достижения желаемой цели достаточно внести лишь небольшое изменение в стандартный протокол ПЦР:

Мультиплексная ПЦР использует несколько пар праймеров, отжигающихся на различных целевых последовательностях. Это позволяет проводить одновременный анализ нескольких целей в одном образце. Например, при тестировании на генетические мутации можно объединить шесть или более амплификации. В стандартном протоколе ДНК-фингерпринтинга исследуемые цели часто амплифицируются группами по 3 или 4. Мультиплексная лигирующая зависимая зондовая амплификация ( MLPA ) позволяет амплифицировать несколько целей с использованием только одной пары праймеров, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР. Мультиплексная ПЦР также использовалась для анализа микросателлитов и SNP . [ 1]

Различия в длине VNTR у шести индивидуумов

ПЦР с переменным числом тандемных повторов (VNTR) нацелена на повторяющиеся области генома, которые демонстрируют вариации длины . Анализ генотипов в образцах обычно включает определение размеров продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза . Анализ более мелких сегментов VNTR, известных как короткие тандемные повторы (или STR), является основой для баз данных ДНК-отпечатков пальцев, таких как CODIS .

Асимметричная ПЦР предпочтительно амплифицирует одну цепь двухцепочечной ДНК-мишени. Она используется в некоторых методах секвенирования и гибридизационного зондирования для получения одной цепи ДНК в качестве продукта. Термоциклирование выполняется точно так же, как в обычной ПЦР, но с ограничением количества или без одного из праймеров. Когда ограничивающий праймер истощается, репликация увеличивается арифметически , а не экспоненциально за счет удлинения избыточного праймера. [2] Модификация этого процесса, называемая Линейно - После - Т - Экспоненциальной -ПЦР (или LATE-ПЦР ), использует ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления (T m ), чем избыточный праймер, чтобы поддерживать эффективность реакции, поскольку концентрация ограничивающего праймера уменьшается в середине реакции. [3] См. также ПЦР с перекрытием и удлинением .

Для выполнения длинной ПЦР необходимы некоторые модификации . Первоначальный процесс ПЦР на основе Кленова не генерировал продукты, которые были больше, чем около 400 п.н. Однако полимераза Taq может амплифицировать мишени длиной до нескольких тысяч п.н. [4] С тех пор модифицированные протоколы с ферментом Taq позволили амплифицировать мишени длиной более 50 кб. [5]

Вложенная ПЦР

Вложенная ПЦР используется для повышения специфичности амплификации ДНК. Два набора праймеров используются в двух последовательных реакциях. В первой ПЦР одна пара праймеров используется для генерации продуктов ДНК, которые могут содержать продукты, амплифицированные из нецелевых областей. Продукты из первой ПЦР затем используются в качестве матрицы во второй ПЦР с использованием одного («геминестинг») или двух разных праймеров, сайты связывания которых расположены (вложенные) в пределах первого набора, тем самым повышая специфичность. Вложенная ПЦР часто более успешна в специфической амплификации длинных продуктов ДНК, чем обычная ПЦР, но она требует более детального знания последовательности цели.

Количественная ПЦР ( qPCR ) используется для измерения определенного количества целевой ДНК (или РНК) в образце. Измеряя амплификацию только в фазе истинного экспоненциального увеличения, количество измеряемого продукта точнее отражает начальное количество мишени. Используются специальные термоциклеры, которые контролируют количество продукта во время амплификации.

Количественная ПЦР в реальном времени ( QRT-PCR ), иногда называемая просто ПЦР в реальном времени ( RT-PCR ), относится к набору методов, в которых используются флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, или ДНК-зонды, содержащие флуорофор , такие как TaqMan , для измерения количества амплифицированного продукта в реальном времени по мере прогрессирования амплификации.

ПЦР с горячим стартом — это метод, выполняемый вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры плавления ДНК (например, 95 °C) перед добавлением полимеразы. Таким образом, предотвращается неспецифическая амплификация при более низких температурах. [6] В качестве альтернативы специализированные реагенты ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды либо путем связывания антитела , либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после этапа активации при высокой температуре. «ПЦР с горячим стартом/холодным финишем» достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и активируются только при повышенных температурах.

В touchdown PCR температура отжига постепенно снижается в более поздних циклах. Температура отжига в ранних циклах обычно на 3–5 °C выше стандартной T m используемых праймеров, тогда как в более поздних циклах она на такую ​​же величину ниже T m . Начальная более высокая температура отжига приводит к большей специфичности связывания праймера, тогда как более низкие температуры позволяют проводить более эффективную амплификацию в конце реакции. [7]

Сборочная ПЦР (также известная как сборка полимеразного цикла или ПЦР ) — это синтез длинных структур ДНК путем проведения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами для сборки двух или более фрагментов ДНК в один фрагмент. Она включает в себя начальную ПЦР с праймерами, которые имеют перекрытие, и вторую ПЦР с использованием продуктов в качестве матрицы, которая генерирует конечный полноразмерный продукт. Эта техника может заменитьсборку на основе лигирования . [8]

В ПЦР колоний бактериальные колонии проверяются непосредственно с помощью ПЦР, например, проверка на наличие правильных векторных конструкций ДНК. Колонии отбираются стерильным наконечником пипетки, и небольшое количество клеток переносится в смесь ПЦР. Чтобы высвободить ДНК из клеток, ПЦР либо начинается с увеличенного времени при 95 °C (когда используется стандартная полимераза), либо с укороченным этапом денатурации при 100 °C и специальной химерной ДНК-полимеразой. [9]

Цифровая полимеразная цепная реакция одновременно амплифицирует тысячи образцов, каждый из которых находится в отдельной капле внутри эмульсии или в перегородке внутри микролуночного планшета.

Suicide PCR обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где первостепенное значение имеет избежание ложноположительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента. Первоначально он был описан в исследовании по проверке наличия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, полученных из захоронений людей 14-го века, предположительно убитых чумой во время средневековой эпидемии Черной смерти . [10] Метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), что никогда не должно было использоваться в любой реакции ПЦР с положительным контролем, и праймеры всегда должны быть нацелены на геномную область, которая никогда ранее не амплифицировалась в лаборатории с использованием этого или любого другого набора праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет загрязняющей ДНК из предыдущих реакций ПЦР, которая в противном случае могла бы генерировать ложноположительные результаты.

COLD-PCR ( коамплификация при более низкой температуре денатурации - ПЦР) - это модифицированный протокол, который обогащает вариантные аллели из смеси образцов ДНК дикого типа и содержащих мутации.

Предварительная обработка и наращивание

Базовый процесс ПЦР иногда может предшествовать другому методу или следовать за ним.

ОТ-ПЦР (илиПЦРс обратной транскрипцией ) используется для обратной транскрипции и амплификации РНК в кДНК . ПЦР предшествует реакция с использованием обратной транскриптазы , фермента, который преобразует РНК в кДНК. Две реакции можно объединить в пробирке, при этом начальный этап нагревания ПЦР используется для инактивации транскриптазы. [ 4] Полимераза Tth (описанная ниже) обладает активностью ОТ и может выполнять всю реакцию. ОТ-ПЦР широко используется в профилировании экспрессии , которое обнаруживает экспрессию гена. Его также можно использовать для получения последовательности транскрипта РНК, что может помочь определить сайты начала и окончания транскрипции (с помощью RACE-ПЦР ) и облегчить картирование расположения экзонов и интронов в последовательности гена.

Двухконечная ПЦР использует один праймер, который связывается с микроРНК-мишенью как с 3'-, так и с 5'-концами, известными как полузонды. [11] Оба конца должны быть комплементарными для связывания. Затем 3'-конец удлиняется обратной транскриптазой, образуя длинную кДНК. Затем кДНК амплифицируется с использованием двух целевых специфичных ПЦР-праймеров. Сочетание двух полузондов, оба из которых нацелены на короткую микроРНК-мишень, делает двухконечный анализ чрезвычайно чувствительным и специфичным.

Лигационная ПЦР использует небольшие ДНК-олигонуклеотидные «линкеры» (или адаптеры), которые сначала лигируются с фрагментами целевой ДНК. Праймеры ПЦР, которые отжигаются с последовательностями линкера, затем используются для амплификации целевых фрагментов. Этот метод применяется для секвенирования ДНК, геномной прогулки и ДНК-отпечатков . [12] Связанная с этим методика — полиморфизм длины амплифицированного фрагмента , который генерирует диагностические фрагменты генома.

Метилирование-специфическая ПЦР ( MSP ) используется для идентификации паттернов метилирования ДНК на цитозин-гуаниновых (CpG) островах в геномной ДНК. [13] Целевая ДНК сначала обрабатывается бисульфитом натрия , который преобразует неметилированные основания цитозина в урацил , который комплементарен аденозину в праймерах ПЦР. Затем на обработанной бисульфитом ДНК проводятся две амплификации: один набор праймеров отжигается с ДНК с цитозинами (соответствующими метилированному цитозину), а другой набор отжигается с ДНК с урацилом (соответствующим неметилированному цитозину). MSP, используемый в количественной ПЦР, дает количественную информацию о состоянии метилирования данного острова CpG. [14]

Другие модификации

Для достижения оптимальной производительности обычно используется регулировка компонентов в ПЦР.

Двухвалентный ион магния (Mg ++ ) необходим для активности полимеразы ПЦР. Более низкие концентрации Mg ++ увеличат точность репликации, в то время как более высокие концентрации приведут к большему количеству мутаций. [15]

Денатуранты (например, ДМСО ) могут повышать специфичность амплификации, дестабилизируя неспецифическое связывание праймера. Другие химикаты, например, глицерин , являются стабилизаторами активности полимеразы во время амплификации. Детергенты (например, Тритон X-100 ) могут предотвращать прилипание полимеразы к себе или к стенкам реакционной пробирки.

ДНК-полимеразы иногда включают несоответствующие основания в удлиняющуюся цепь. Высокоточная ПЦР использует ферменты с 3'-5' экзонуклеазной активностью, которая снижает эту скорость неправильного включения. Примерами ферментов с корректирующей активностью являются Pfu ; корректировки концентраций Mg ++ и dNTP могут помочь максимизировать количество продуктов, которые точно соответствуют исходной целевой ДНК. [ необходима цитата ]

Модификации праймера

Корректировки синтетических олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров в ПЦР, представляют собой богатый источник модификаций:

Обычно праймеры ПЦР выбираются из инвариантной части генома и могут использоваться для амплификации полиморфной области между ними. В аллель-специфической ПЦР делается наоборот. По крайней мере один из праймеров выбирается из полиморфной области с мутациями, расположенными на (или около) его 3'-конце. В строгих условиях несоответствующий праймер не будет инициировать репликацию, тогда как соответствующий праймер будет. Таким образом, появление продукта амплификации указывает на генотип. (Для получения дополнительной информации см. Генотипирование SNP .)

InterSequence-Specific PCR (или ISSR-PCR ) — это метод ДНК-фингерпринтинга , который использует праймеры, выбранные из сегментов, повторяющихся по всему геному, для получения уникального отпечатка длин амплифицированных продуктов. [16] Использование праймеров из часто повторяющегося сегмента называется Alu-PCR и может помочь амплифицировать последовательности, смежные (или между) этими повторами.

Праймеры также могут быть разработаны так, чтобы быть «вырожденными» — способными инициировать репликацию из большого количества целевых мест. Полногеномная амплификация (или WGA ) — это группа процедур, которые позволяют амплификации происходить во многих местах в неизвестном геноме, и которые могут быть доступны только в небольших количествах. Другие методы используют вырожденные праймеры , которые синтезируются с использованием нескольких нуклеотидов в определенных положениях (полимераза «выбирает» правильно соответствующие праймеры). Кроме того, праймеры могут быть синтезированы с нуклеозидным аналогом инозином , который гибридизуется с тремя из четырех нормальных оснований. Подобный метод может заставить ПЦР выполнять направленный мутагенез . (также см. Полимеразная цепная реакция с перекрытием )

Обычно праймеры, используемые в ПЦР, разрабатываются так, чтобы быть полностью комплементарными мишени. Однако полимераза устойчива к несовпадениям вдали от 3'-конца. Хвостовые праймеры включают некомплементарные последовательности на своих 5'-концах. Распространенной процедурой является использование линкерных праймеров , которые в конечном итоге размещают сайты рестрикции на концах продуктов ПЦР, облегчая их последующую вставку в клонирующие векторы.

Расширение метода «колонии-ПЦР» (выше) заключается в использовании векторных праймеров . Целевые фрагменты ДНК (или кДНК) сначала вставляются в клонирующий вектор , и для областей вектора, фланкирующих сайт вставки, разрабатывается один набор праймеров. Амплификация происходит для любой вставленной ДНК. [4]

ПЦР можно легко модифицировать для получения меченого продукта для последующего использования в качестве гибридизационного зонда. Один или оба праймера могут использоваться в ПЦР с уже прикрепленной радиоактивной или флуоресцентной меткой, или метки могут быть добавлены после амплификации. Эти методы маркировки можно комбинировать с «асимметричной ПЦР» (выше) для получения эффективных гибридизационных зондов.

РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР) может уменьшить образование димеров праймеров и увеличить количество анализов в мультиплексной ПЦР. Метод использует праймеры с расщепляемым блоком на 3'-конце, который удаляется под действием термостабильного фермента РНКазы HII. [17]

ДНК-полимеразы

В ПЦР используется несколько ДНК-полимераз.

Фрагмент Кленова , полученный из оригинальной ДНК-полимеразы I из E. coli , был первым ферментом, использованным в ПЦР. Из-за его низкой стабильности при высокой температуре его необходимо пополнять в течение каждого цикла, и поэтому он обычно не используется в ПЦР.

ДНК-полимераза бактериофага T4 (семейство A) также изначально использовалась в ПЦР. Она имеет более высокую точность репликации, чем фрагмент Кленова, но также разрушается под воздействием тепла. ДНК-полимераза T7 (семейство B) имеет схожие свойства и цели. Она применялась для направленного мутагенеза [18] и секвенирования по Сэнгеру . [19]

Taq -полимераза, ДНК-полимераза I из Thermus aquaticus , была первой термостабильной полимеразой, использованной в ПЦР, и до сих пор является наиболее часто используемой. Фермент может быть выделен из его нативного источника или из его клонированного гена, экспрессированного в E. coli . [4] 61kDa укороченный из-за отсутствия 5'-3' экзонуклеазной активности известен как фрагмент Стоффеля и экспрессируется в E. coli . [20] Отсутствие экзонуклеазной активности может позволить ему амплифицировать более длинные цели, чем нативный фермент. Он был коммерциализирован как AmpliTaq и Klentaq . [21] Также был получен вариант, разработанный для ПЦР с горячим стартом, называемый «полимеразой быстрого старта». Он требует сильной тепловой активации, тем самым избегая неспецифической амплификации из-за полимеразной активности при низкой температуре.Было создано много других вариантов . [22]

Другие полимеразы Thermus , такие как полимераза Tth I ( P52028 ) из Thermus thermophilus , нашли некоторое применение. Tth обладает обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn2 + , что позволяет проводить ПЦР-амплификацию из РНК-мишеней. [23]

Архейный род Pyrococcus оказался богатым источником термостабильных полимераз с корректирующей активностью. ДНК-полимераза Pfu , выделенная из P. furiosus, показывает 5-кратное снижение частоты ошибок репликации по сравнению с Taq. [24] Поскольку ошибки увеличиваются по мере прогрессирования ПЦР, Pfu является предпочтительной полимеразой, когда продукты должны быть индивидуально клонированы для секвенирования или экспрессии. Другие менее используемые полимеразы из этого рода включают Pwo ( P61876 ) из Pyrococcus woesei , Pfx из неназванного вида, полимеразу "Deep Vent" ( Q51334 ) из штамма GB-D. [25]

Vent или Tli полимераза — это чрезвычайно термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из Thermococcus litoralis . Полимераза из Thermococcus fumicolans ( Tfu ) также была коммерциализирована. [25]

Модификации механизма

Иногда даже базовый механизм ПЦР может быть изменен.

Обратная ПЦР.

В отличие от обычной ПЦР, обратная ПЦР позволяет амплификацию и секвенирование ДНК, которая окружает известную последовательность. Она включает в себя первоначальное подвергание целевой ДНК серии рестриктаз , а затем кольцевание полученных фрагментов путем самолигирования . Праймеры разработаны для расширения наружу от известного сегмента, что приводит к амплификации остальной части круга. Это особенно полезно при идентификации последовательностей по обе стороны от различных геномных вставок. [26]

Аналогично, термическая асимметричная перемежающаяся ПЦР (или TAIL-PCR ) используется для изоляции неизвестных последовательностей, фланкирующих известную область генома. В пределах известной последовательности TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с различными температурами отжига. «Вырожденный» праймер используется для амплификации в другом направлении от неизвестной последовательности. [27]

Методы изотермической амплификации

Были разработаны некоторые протоколы амплификации ДНК, которые могут использоваться в качестве альтернативы ПЦР. Они изотермичны, что означает, что они работают при постоянной температуре. [28]

Хеликаза-зависимая амплификация (HDA) похожа на традиционную ПЦР, но использует постоянную температуру вместо циклов денатурации и отжига/удлинения. ДНК-хеликаза , фермент, который раскручивает ДНК, используется вместо термической денатурации. [29] Петлевая изотермическая амплификация — это похожая идея, но выполняется с помощью полимеразы, вытесняющей цепь. [30]

Реакция амплификации с использованием фермента никирования (NEAR) и ее родственная реакция амплификации с замещением цепи (SDA) являются изотермическими, реплицирующими ДНК при постоянной температуре с использованием полимеразы и фермента никирования. [28]

Рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA) [31] использует рекомбиназу для специфического спаривания праймеров с двухцепочечной ДНК на основе гомологии, таким образом направляя синтез ДНК из определенных последовательностей ДНК, присутствующих в образце. Наличие целевой последовательности инициирует амплификацию ДНК, и не требуется термического или химического плавления ДНК. Реакция протекает быстро и приводит к специфической амплификации ДНК всего от нескольких целевых копий до обнаруживаемых уровней, как правило, в течение 5–10 минут. Вся реакционная система стабильна в виде высушенной формулы и не требует охлаждения. RPA может использоваться для замены ПЦР в различных лабораторных приложениях, и пользователи могут разрабатывать свои собственные анализы. [32]

Другие типы изотермической амплификации включают полногеномную амплификацию (WGA), амплификацию на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) и амплификацию, опосредованную транскрипцией (TMA). [28]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (2008). "Multiplex-Ready PCR: новый метод мультиплексного генотипирования SSR и SNP". BMC Genomics . 9 : 80. doi : 10.1186/1471-2164-9-80 . PMC  2275739. PMID  18282271 .
  2. ^ Иннис МА, Мьямбо КБ, Гельфанд ДХ, Брау МА (декабрь 1988 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и прямое секвенирование ДНК, амплифицированной полимеразной цепной реакцией». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 85 (24): 9436–40. Bibcode :1988PNAS...85.9436I. doi : 10.1073/pnas.85.24.9436 . PMC 282767 . PMID  3200828. 
  3. ^ Pierce KE, Wangh LJ (2007). "Линейная послеэкспоненциальная полимеразная цепная реакция и смежные технологии". Диагностика отдельных клеток . Методы в молекулярной медицине. Т. 132. С. 65–85. doi :10.1007/978-1-59745-298-4_7. ISBN 978-1-58829-578-1. PMID  17876077. {{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )
  4. ^ abcd Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. (январь 1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Science . 239 (4839): 487–91. Bibcode :1988Sci...239..487S. doi :10.1126/science.239.4839.487. PMID  2448875.
  5. ^ Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (июнь 1994 г.). «Эффективная амплификация длинных мишеней из клонированных вставок и человеческой геномной ДНК». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 91 (12): 5695–9. Bibcode : 1994PNAS...91.5695C. doi : 10.1073/pnas.91.12.5695 . PMC 44063. PMID  8202550. 
  6. ^ Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (апрель 1992 г.). «Предотвращение неправильного праймирования перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификацию с низким числом копий». Nucleic Acids Res . 20 (7): 1717–23. doi :10.1093/nar/20.7.1717. PMC 312262. PMID  1579465 . 
  7. ^ Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (июль 1991 г.). «ПЦР 'Touchdown' для обхода ложного праймирования во время амплификации гена». Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. doi :10.1093/nar/19.14.4008. PMC 328507. PMID  1861999 . 
  8. ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (1995). «Одношаговая сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Gene . 164 (1): 49–53. doi :10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID  7590320.
  9. ^ Павлов AR, Павлова NV, Козявкин SA, Слесарев AI (2006). "Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибридного TopoTaq с другими ферментами". В Kieleczawa J (ред.). Секвенирование ДНК II: оптимизация подготовки и очистки . Jones and Bartlett. стр. 241–257. ISBN 978-0-7637-3383-4.
  10. ^ Raoult, D; G Aboudharam; E Crubezy; G Larrouy; B Ludes; M Drancourt (2000-11-07). "Молекулярная идентификация методом "суицидной ПЦР" Yersinia pestis как агента средневековой черной смерти". Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 97 (23): 12800–12803. Bibcode : 2000PNAS...9712800R. doi : 10.1073/pnas.220225197 . ISSN  0027-8424. PMC 18844. PMID 11058154  . 
  11. ^ Андрович, Питер; Валихрах, Лукас; Эллинг, Джули; Сьобак, Роберт; Кубиста, Микаэль (2017). «Двуххвостая ОТ-ПЦР: новый метод высокоточной количественной оценки микроРНК». Nucleic Acids Research . 45 (15): e144. doi : 10.1093/nar/gkx588. ISSN  0305-1048. PMC 5587787. PMID  28911110. 
  12. ^ Mueller PR, Wold B (ноябрь 1989). "In vivo footprinting of a muscle Specific Enhancer by ligation mediated PCR". Science . 246 (4931): 780–6. Bibcode :1989Sci...246..780M. doi :10.1126/science.2814500. PMID  2814500.
  13. ^ Herman JG , Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (сентябрь 1996 г.). "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands". Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 93 (18): 9821–6. Bibcode : 1996PNAS...93.9821H. doi : 10.1073/pnas.93.18.9821 . PMC 38513. PMID  8790415. 
  14. ^ Эрнандес, Х.; Це, М.Ю.; Панг, С.С.; Арболеда, Х.; Фореро, Д.А. (октябрь 2013 г.). «Оптимизация методологий для анализа метилирования ДНК на основе ПЦР». BioTechniques . 55 (4): 181–197. doi : 10.2144/000114087 . PMID  24107250.
  15. ^ Markoulatos, P; Siafakas, N; Moncany, M (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход». Журнал клинического лабораторного анализа . 16 (1): 47–51. doi :10.1002/jcla.2058. PMC 6808141. PMID  11835531 . 
  16. ^ E. Zietkiewicz; A. Rafalski & D. Labuda (1994). «Геномный дактилоскопический анализ с помощью амплификации полимеразной цепной реакции с простым повтором последовательности (SSR)». Genomics . 20 (2): 176–83. doi :10.1006/geno.1994.1151. PMID  8020964. S2CID  41802285.
  17. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA (август 2011 г.). «ПЦР, зависимая от РНКазы H (рПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием заблокированных расщепляемых праймеров». BMC Biotechnology . 11 : 80. doi : 10.1186/1472-6750-11-80 . PMC 3224242. PMID  21831278 . 
  18. ^ Venkitaraman AR (апрель 1989). «Использование модифицированной ДНК-полимеразы T7 (секвеназа версии 2.0) для направленного мутагенеза олигонуклеотидов». Nucleic Acids Research . 17 (8): 3314. doi :10.1093/nar/17.8.3314. PMC 317753. PMID  2726477 . 
  19. ^ «Термосеквеназа ДНК-полимераза».
  20. ^ Lawyer, FC; Stoffel, S.; Saiki, RK; Chang, SY; Landre, PA; Abramson, RD; Gelfand, DH (1993-05-01). "Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы, дефицитной по 5'-3' экзонуклеазной активности". Методы и применение ПЦР . 2 (4): 275–287. doi : 10.1101/gr.2.4.275 . ISSN  1054-9803. PMID  8324500.
  21. ^ "Прикладные биосистемы - Поддержка". www6.appliedbiosystems.com .
  22. ^ Villbrandt, B; Sobek, H; Frey, B; Schomburg, D (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana». Protein Engineering . 13 (9): 645–54. doi : 10.1093/protein/13.9.645 . PMID  11054459.
  23. ^ https://www.promega.in/products/pcr/rt-pcr/tth-dna-polymerase/ [ мертвая ссылка ]
  24. ^ Cline J, Braman JC, Hogrefe HH (сентябрь 1996 г.). «ПЦР-точность pfu ДНК-полимеразы и других термостабильных ДНК-полимераз». Nucleic Acids Res . 24 (18): 3546–51. doi :10.1093/nar/24.18.3546. PMC 146123. PMID  8836181 . 
  25. ^ ab van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). "Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы". Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . стр. 103–18. doi :10.1007/978-1-4020-6241-4_7. ISBN 978-1-4020-6240-7.
  26. ^ Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1 ноября 1988 г.). «Генетические применения обратной полимеразной цепной реакции». Genetics . 120 (3): 621–3. doi :10.1093/genetics/120.3.621. PMC 1203539 . PMID  2852134. 
  27. ^ Лю YG, Уиттиер RF (февраль 1995 г.). «Термическая асимметричная перемежающаяся ПЦР: автоматическая амплификация и секвенирование фрагментов концов вставок из клонов P1 и YAC для прогулки по хромосоме». Геномика . 25 (3): 674–81. doi :10.1016/0888-7543(95)80010-J. PMID  7759102.
  28. ^ abc "Изотермическая амплификация - Обзор применения". New England BioLabs, Inc. 2020 . Получено 13 августа 2020 .
  29. ^ Vincent M, Xu Y, Kong H (август 2004 г.). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК». EMBO Rep . 5 (8): 795–800. doi :10.1038/sj.embor.7400200. PMC 1249482. PMID  15247927 . 
  30. ^ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000). «Изотермическая амплификация ДНК, опосредованная петлей». Nucleic Acids Res . 28 (12): 63e–63. doi :10.1093/nar/28.12.e63. PMC 102748. PMID 10871386  . 
  31. ^ Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA (2006). «Обнаружение ДНК с использованием рекомбинационных белков». PLOS Biol . 4 (7): e204. doi : 10.1371/journal.pbio.0040204 . PMC 1475771. PMID  16756388 . 
  32. ^ Lutz S, Weber P, Focke M, Faltin B, Hoffmann J, Müller C, Mark D, Roth G, Munday P, Armes N, Piepenburg O, Zengerle R, von Stetten F (апрель 2010 г.). «Микрожидкостная лаборатория на фольге для анализа нуклеиновых кислот на основе изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA)». Lab Chip . 10 (7): 887–93. doi :10.1039/b921140c. PMID  20300675.

Внешние ссылки