Лизат амебоцитов Limulus ( LAL ) представляет собой водный экстракт подвижных клеток крови ( амебоцитов ) атлантического мечехвоста Limulus polyphemus . ЛАЛ реагирует с бактериальными эндотоксинами, такими как липополисахариды (ЛПС), которые являются компонентами бактериальной капсулы , внешней мембраны клеточной оболочки грамотрицательных бактерий . Эта реакция лежит в основе LAL-теста , который широко используется для обнаружения и количественного определения бактериальных эндотоксинов .
В Азии вместо этого иногда используется аналогичный тест на лизат амебоцитов Tachypleus ( TAL ), основанный на местных мечехвостах Tachypleus gigas или Tachypleus tridentatus . [1] Анализ рекомбинантного фактора C (rFC) представляет собой замену LAL и TAL, основанную на аналогичной реакции. [2]
Американский медицинский исследователь Фред Банг сообщил в 1956 году, что грамотрицательные бактерии, даже если их убить, заставят кровь мечехвоста превратиться в гель , разновидность полутвердой массы. Позже было признано, что клетки крови животных, подвижные клетки, называемые амебоцитами , содержат гранулы с фактором свертывания крови , известным как коагулоген ; он высвобождается за пределы клетки при контакте с бактериальными эндотоксинами. Считается, что после коагуляции и последующего гелеобразования полученный гель содержит бактериальные инфекции в полузакрытой системе кровообращения животного . [3] Современный анализ лизата привел к пониманию этой каскадной системы, в которой несколько ферментов последовательно работают для производства геля. Точкой входа в процесс свертывания крови, индуцированного эндотоксином, является фактор свертывания крови Limulus C. [4]
В 1977 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило LAL для тестирования лекарств, продуктов и устройств, вступающих в контакт с кровью. До этой даты для этой цели использовался гораздо более медленный и более дорогой тест на кроликах . [5]
Мечехвоста собирают и из перикарда мечехвоста удаляют кровь ; некоторых крабов затем возвращают в воду, а других продают, чтобы съесть или использовать в качестве приманки. Компании, добывающие LAL из мечехвостов, до 2008 года заявляли, что уровень смертности был ниже 3%. [6] Исследование Массачусетского отдела морского рыболовства, проведенное в 2009 году, показало, что более ранние исследования выявили от 5 до 15% смертности среди мужчин и, по одной оценке, в 29% среди женщин. Само исследование показало, что 22% самок немедленно возвращаются в воду, а 30% самок остаются на ночь в целях коммерческой практики. [7] Клетки крови отделяются от сыворотки с помощью центрифугирования , а затем помещаются в дистиллированную воду, в результате чего они набухают и лопаются («лизируются»). При этом химические вещества высвобождаются изнутри клетки («лизат»), которые затем очищаются и подвергаются сублимационной сушке . Чтобы проверить образец на эндотоксины, его смешивают с лизатом и водой; эндотоксины присутствуют, если происходит коагуляция. [8]
Существует три основных метода: гель-сгусток, турбидиметрический и хромогенный . Основным применением LAL является тестирование парентеральных фармацевтических препаратов и медицинских устройств, контактирующих с кровью или спинномозговой жидкостью . В США FDA опубликовало руководство по валидации теста LAL в качестве теста на эндотоксин для таких продуктов. [9]
Каскад LAL также запускается (1,3)-β-D-глюканом через другой фактор G. И бактериальные эндотоксины, и (1,3)-β-D-глюкан считаются патоген-ассоциированными молекулярными паттернами , или PAMP. , вещества, вызывающие воспалительные реакции у млекопитающих . [10]
Одним из наиболее трудоемких аспектов тестирования эндотоксинов с использованием LAL является предварительная обработка образцов для преодоления ингибирования анализа, которое может помешать тесту LAL, что повлияет на выделение эндотоксина. Если тестируемый продукт вызывает меньшее, чем ожидалось, выделение эндотоксина, продукт ингибирует тест LAL. Продукты, которые дают более высокие, чем ожидалось, значения, улучшаются. Преодоление ингибирующих и улучшающих свойств продукта требуется FDA в рамках валидации теста LAL для использования при окончательном тестировании выпуска инъекционных препаратов и медицинских устройств. Прежде чем можно будет использовать LAL для высвобождения продукта, необходимо доказать правильность извлечения эндотоксина. [11]
LAL-тест является основным источником зависимости от продуктов животного происхождения в биомедицинской промышленности и бросает вызов трем принципам науки в отношении использования животных в тестировании. Учитывая сообщения о более высоком, чем ожидалось, уровне смертности [7], было сочтено более этичным разработать альтернативы тесту. [12] С 2003 года коммерчески доступен заменитель рекомбинантного белка для использования в тесте LAL. Названный анализом рекомбинантного фактора C (rFC), он основан на том же белке фактора свертывания крови C Limulus , но продуцируется генетически модифицированными клетками насекомых (используемая конкретная последовательность фактора C не обязательно происходит от атлантического мечехвоста). [5]
Вместо имитации всего пути свертывания крови тесты RFC позволяют фактору C расщеплять синтетический флуорогенный субстрат, так что образец светится, когда эндотоксин активирует фактор. Поскольку (1,3)-β-D-глюкан не содержит фактора G, он не вызывает ложноположительных результатов . По состоянию на 2018 год имеющиеся данные показывают, что тест RFC не хуже теста LAL. [13]
Внедрение теста RFC шло медленно, и ситуация начала меняться в 2012 году, когда FDA США и министерство здравоохранения Европы признали его приемлемой альтернативой. Отсутствие упоминания о нем в фармакопеях оставалось проблемой, поскольку не существовало хорошего стандарта для проведения теста в производстве. [13] В 2016 году он был добавлен в Европейскую Фармакопею . [5] Патент на RFC также ограничивал распространение до истечения срока его действия в 2018 году. [13]
1 июня 2020 года Фармакопея США (USP) решила отменить предложение о включении рекомбинантной технологии для тестирования эндотоксинов в главу 85 « Бактериальные эндотоксины» и начать разработку отдельной главы, в которой подробно рассматриваются использование, валидация и сопоставимость тесты на эндотоксины на основе рекомбинантных реагентов. Отдельная глава 1085.1, предназначенная только для рекомендаций, была предложена USP, хотя комментарии и отзывы, опубликованные 11 декабря 2020 года, показывают, что фармацевтические компании и FDA не поддерживают эту главу и запрашивают статус справочника. [14]
Тест активации моноцитов (MAT) — еще один предложенный метод проверки эндотоксинов на основе моноцитов в крови человека . Он измеряет высвобождение цитокинов из них из-за присутствия пирогенов , что по существу отражает процесс, посредством которого эти токсины вызывают лихорадку у людей (и кроликов, как в оригинальном тесте на пирогенность). [15] Протокол теста MAT с использованием культивируемых клеток описан в Европейской Фармакопее. [16]
Недавнее исследование с использованием генетически модифицированных моноцитов позволило значительно повысить чувствительность методов обнаружения на основе моноцитов за счет сокращения времени завершения анализа с более чем 20 часов до 2–3 часов. [17]
Прежде чем можно будет использовать LAL для высвобождения продукта, необходимо доказать правильность извлечения эндотоксина.