В органической химии пептидный синтез — это производство пептидов , соединений, в которых несколько аминокислот связаны амидными связями, также известными как пептидные связи . Пептиды химически синтезируются путем реакции конденсации карбоксильной группы одной аминокислоты в аминогруппу другой. Стратегии защиты групп обычно необходимы для предотвращения нежелательных побочных реакций с различными боковыми цепями аминокислот. [1] Химический синтез пептидов чаще всего начинается с карбоксильного конца пептида (С-конец) и продолжается к аминоконцу ( N-конец ). [2] Биосинтез белков (длинных пептидов) в живых организмах происходит в обратном направлении.
Химический синтез пептидов можно проводить с использованием классических методов растворенной фазы, хотя в большинстве исследовательских и опытно-конструкторских работ они были заменены твердофазными методами (см. Ниже). [3] Более того, синтез в фазе раствора сохраняет свою полезность при крупномасштабном производстве пептидов для промышленных целей.
Химический синтез облегчает производство пептидов, которые трудно экспрессировать в бактериях, включение неприродных аминокислот, модификацию основной цепи пептида/белка и синтез D-белков, которые состоят из D-аминокислот .
Установленный метод производства синтетических пептидов в лаборатории известен как твердофазный пептидный синтез (SPPS). [2] Пионер Роберта Брюса Меррифилда , [4] [5] SPPS позволяет быстро собирать пептидную цепь посредством последовательных реакций производных аминокислот на макроскопически нерастворимой, набухшей в растворителе смоляной подложке в виде шариков. [ нужна цитата ]
Твердый носитель состоит из небольших шариков полимерной смолы, функционализированных реакционноспособными группами (такими как амино- или гидроксильные группы), которые связываются с формирующейся пептидной цепью. [2] Поскольку пептид остается ковалентно связанным с носителем на протяжении всего синтеза, излишки реагентов и побочные продукты можно удалить промыванием и фильтрацией. Этот подход позволяет избежать сравнительно трудоемкого выделения пептидного продукта из раствора после каждой стадии реакции, что потребовалось бы при использовании обычного синтеза в растворе. [ нужна цитата ]
Каждая аминокислота, подлежащая соединению с N-концом пептидной цепи, должна быть защищена на ее N-конце и боковой цепи с использованием соответствующих защитных групп, таких как Boc (кислотно-лабильная) или Fmoc (лабильная к основаниям), в зависимости от боковой цепи и используемая стратегия защиты (см. ниже). [1]
Общая процедура SPPS представляет собой один из повторяющихся циклов поочередного снятия защиты с N-конца и реакций связывания. Смолу можно промывать между каждым этапом. [2] Сначала к смоле присоединяется аминокислота. Впоследствии с амина снимают защиту, а затем он соединяется с активированной карбоксильной группой следующей добавляемой аминокислоты. Этот цикл повторяется до тех пор, пока желаемая последовательность не будет синтезирована. Циклы SPPS могут также включать этапы кэпирования, которые блокируют реакцию концов непрореагировавших аминокислот. В конце синтеза неочищенный пептид отщепляется от твердого носителя при одновременном удалении всех защитных групп с использованием такого реагента, как трифторуксусная кислота. [2] Неочищенный пептид можно осаждать из неполярного растворителя, такого как диэтиловый эфир, чтобы удалить органические растворимые побочные продукты. Неочищенный пептид можно очистить с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ . [6] [7] Процесс очистки, особенно более длинных пептидов, может быть сложным, поскольку необходимо удалить совокупные количества многочисленных второстепенных побочных продуктов, которые имеют свойства, аналогичные желаемому пептидному продукту. По этой причине так называемые процессы непрерывной хроматографии, такие как MCSGP, все чаще используются в коммерческих целях для максимизации выхода без ущерба для чистоты. [8]
SPPS ограничен выходами реакций из-за экспоненциального накопления побочных продуктов, и обычно пептиды и белки в диапазоне от 70 аминокислот раздвигают границы синтетической доступности. [2] Синтетическая сложность также зависит от последовательности; обычно трудно получить склонные к агрегации последовательности, такие как амилоиды [9] . Доступ к более длинным длинам можно получить, используя подходы лигирования, такие как нативное химическое лигирование , при котором два более коротких синтетических пептида с полностью снятой защитой можно соединить в растворе.
Важной особенностью, которая позволила широко применять SPPS, является получение чрезвычайно высоких выходов на этапе соединения. [2] Требуются высокоэффективные условия образования амидной связи. Чтобы проиллюстрировать влияние неоптимальных выходов сочетания для данного синтеза, рассмотрим случай, когда каждая стадия сочетания должна была иметь выход не менее 99%: это привело бы к общему выходу сырого продукта 77% для пептида из 26 аминокислот (при условии, что 100% выход при каждом снятии защиты); если бы эффективность каждой муфты составляла 95 %, общий выход составил бы 25 %. [10] [11] и добавление избытка каждой аминокислоты (от 2 до 10 раз). Минимизация рацемизации аминокислот во время связывания также имеет жизненно важное значение, чтобы избежать эпимеризации в конечном пептидном продукте. [ нужна цитата ]
Образование амидной связи между амином и карбоновой кислотой происходит медленно и поэтому обычно требует «связывающих реагентов» или «активаторов». Существует широкий спектр реагентов сочетания, отчасти из-за их различной эффективности для конкретных соединений. [12] [13] многие из этих реагентов коммерчески доступны.
Карбодиимиды, такие как дициклогексилкарбодиимид (DCC) и диизопропилкарбодиимид (DIC), часто используются для образования амидной связи. [11] Реакция протекает через образование высокореакционной O - ацилизомочевины . Этот реакционноспособный промежуточный продукт подвергается атаке N-концевого амина пептида, образуя пептидную связь. Образование O - ацилизомочевины быстрее всего происходит в неполярных растворителях, таких как дихлорметан. [14]
DIC особенно полезен для SPPS, поскольку в жидком виде он легко дозируется, а побочный продукт мочевины легко смывается. И наоборот, родственный карбодиимид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) часто используется для связывания пептидов в растворенной фазе, поскольку его побочный продукт мочевина может быть удален промывкой во время водной обработки . [11]
Активация карбодиимида открывает возможность рацемизации активированной аминокислоты. [11] Рацемизацию можно обойти с помощью добавок, «подавляющих рацемизацию», таких как триазолы 1-гидроксибензотриазол (HOBt) и 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt). Эти реагенты атакуют промежуточное соединение O -ацилизомочевины с образованием активного сложного эфира , который впоследствии реагирует с пептидом с образованием желаемой пептидной связи. [15] Этилцианогидроксииминоацетат (Oxyma), добавка для карбодиимидного связывания, действует как альтернатива HOAt. [16]
Некоторые связующие реагенты полностью исключают карбодиимид и включают фрагмент HOAt/HOBt в виде аминий/урониевой или фосфониевой соли ненуклеофильного аниона ( тетрафторбората или гексафторфосфата ). [10] Примеры реагентов аминия/урония включают HATU (HOAt), HBTU / TBTU (HOBt) и HCTU (6-ClHOBt). HBTU и TBTU различаются только выбором аниона. Реагенты фосфония включают PyBOP (HOBt) и PyAOP (HOAt). [ нужна цитата ]
Эти реагенты образуют те же активные эфирные формы, что и условия активации карбодиимида, но различаются скоростью начальной стадии активации, которая определяется природой углеродного скелета связывающего реагента. [17] Кроме того, аминиевые/урониевые реагенты способны вступать в реакцию с N-концом пептида с образованием неактивного гуанидинового побочного продукта, тогда как фосфониевые реагенты этого не делают.
С конца 2000-х годов ангидрид пропанфосфоновой кислоты , продаваемый под разными названиями, например, «T3P», стал полезным реагентом для образования амидных связей в коммерческих целях. Он превращает кислород карбоновой кислоты в уходящую группу, побочные продукты пептидного связывания которой растворимы в воде и легко смываются. При сравнении характеристик ангидрида пропанфосфоновой кислоты и других реагентов для связывания пептидов для получения нонапептидного лекарственного средства было обнаружено, что этот реагент превосходит другие реагенты с точки зрения выхода и низкой эпимеризации. [18]
Твердые подложки для синтеза пептидов выбираются с учетом их физической стабильности и обеспечения быстрой фильтрации жидкостей. Подходящие носители инертны к реагентам и растворителям, используемым во время SPPS, и позволяют присоединить первую аминокислоту. [19] Набухание имеет большое значение, поскольку синтез пептидов происходит внутри набухших пор твердой подложки. [20]
Тремя основными типами твердых опор являются: гелевые опоры, опоры поверхностного типа и композиты. [19] Усовершенствования твердых носителей, используемых для синтеза пептидов, повышают их способность противостоять многократному использованию TFA на этапе снятия защиты с SPPS. [21] Используются две первичные смолы в зависимости от того, требуется ли С-концевая карбоновая кислота или амид. Смола Ванга по состоянию на 1996 год была [обновлять]наиболее часто используемой смолой для пептидов с С-концевыми карбоновыми кислотами. [22] [ нужно обновить ]
Как описано выше, использование защитных групп N-конца и боковой цепи важно во время синтеза пептидов, чтобы избежать нежелательных побочных реакций, таких как самосочетание активированной аминокислоты, приводящее к ( полимеризации ). [1] Это будет конкурировать с предполагаемой реакцией связывания пептидов, что приведет к низкому выходу или даже полной невозможности синтеза желаемого пептида. [ нужна цитата ]
В твердофазном синтезе пептидов обычно используются две принципиальные схемы защитных групп: так называемые подходы Boc/бензил и Fmoc/ трет- бутил. [2] Стратегия Boc/Bzl использует TFA -лабильную N-концевую Boc- защиту наряду с защитой боковой цепи, которая удаляется с помощью безводного фторида водорода во время конечной стадии расщепления (с одновременным отщеплением пептида от твердой подложки). Fmoc/tBu SPPS использует лабильную к основаниям защиту N-конца Fmoc с защитой боковой цепи и смоляной связью, которая является лабильной в кислоте (окончательное кислотное расщепление осуществляется посредством обработки TFA).
Оба подхода, включая преимущества и недостатки каждого, более подробно описаны ниже.
До появления SPPS методы химического синтеза пептидов в растворе основывались на трет -бутилоксикарбониле (сокращенно «Boc») в качестве временной N-концевой α-аминозащитной группы. Вос-группу удаляют кислотой, такой как трифторуксусная кислота (ТФУ). В присутствии избытка TFA образуется положительно заряженная аминогруппа (обратите внимание, что на изображении справа аминогруппа не протонирована), которая нейтрализуется и соединяется с поступающей активированной аминокислотой. [23] Нейтрализация может происходить либо до реакции сочетания, либо in situ во время основной реакции сочетания.
Подход Boc/Bzl сохраняет свою полезность в снижении агрегации пептидов во время синтеза. [24] Кроме того, Boc/бензил SPPS может быть предпочтительнее подхода Fmoc/ трет- бутил при синтезе пептидов, содержащих чувствительные к основаниям фрагменты (такие как депсипептиды или тиоэфирные фрагменты), поскольку обработка основанием требуется на этапе снятия защиты с Fmoc ( см. ниже).
Постоянные защитные группы боковой цепи, используемые во время Boc/бензил-SPPS, обычно представляют собой бензильные группы или группы на основе бензила. [1] Окончательное удаление пептида с твердой подложки происходит одновременно со снятием защиты боковой цепи с использованием безводного фторида водорода посредством гидролитического расщепления. Конечный продукт представляет собой фторидную соль, которую относительно легко растворить. К HF необходимо добавлять поглотители, такие как крезол , чтобы предотвратить образование нежелательных побочных продуктов реактивными катионами.
Использование N-концевой защиты Fmoc позволяет использовать более мягкую схему снятия защиты, чем используемая для Boc/Bzl SPPS, и эта схема защиты действительно ортогональна в условиях SPPS. [26] Для снятия защиты с Fmoc используется основание, обычно 20–50% пиперидина в ДМФ . [19] Таким образом, экспонированный амин является нейтральным, и, следовательно, нейтрализация пептид-смолы не требуется, как в случае подхода Boc/Bzl. Однако отсутствие электростатического отталкивания между пептидными цепями может привести к повышенному риску агрегации с Fmoc/ t Bu SPPS. Поскольку высвобожденная флуоренильная группа представляет собой хромофор, снятие защиты с Fmoc можно контролировать по УФ-поглощению реакционной смеси - стратегия, которая используется в автоматических синтезаторах пептидов.
Способность группы Fmoc расщепляться в относительно мягких основных условиях, сохраняя при этом устойчивость к кислоте, позволяет использовать защитные группы боковой цепи, такие как Boc и t Bu, которые можно удалить в более мягких кислых условиях окончательного расщепления (TFA), чем те, которые используются для окончательное расщепление в Boc/Bzl SPPS (HF). Поглотители, такие как вода и триизопропилсилан (TIPS), чаще всего добавляются во время окончательного расщепления, чтобы предотвратить побочные реакции с активными катионными частицами, высвобождаемыми в результате снятия защиты с боковой цепи. Тем не менее, можно также использовать многие другие соединения-поглотители. [27] [28] [29] Полученный сырой пептид получают в виде соли TFA, которую потенциально труднее растворить, чем фторидные соли, образующиеся в Boc SPPS.
Fmoc/ t Bu SPPS менее экономичен по атомам , поскольку флуоренильная группа намного больше, чем Boc-группа. Соответственно, цены на Fmoc-аминокислоты были высокими до тех пор, пока в 1990-х годах не началось крупномасштабное пилотное тестирование одного из первых синтезированных пептидных препаратов, энфувиртида , когда рыночный спрос скорректировал относительные цены на Fmoc-аминокислоты и Boc-аминокислоты.
Группа (Z) представляет собой еще одну защитную группу амина карбаматного типа, открытую Леонидасом Зервасом в начале 1930-х годов и обычно добавляемую в результате реакции с бензилхлорформиатом . [30]
Его удаляют в жестких условиях с помощью HBr в уксусной кислоте или в более мягких условиях каталитического гидрирования .
Эта методология была впервые использована при синтезе олигопептидов Зервасом и Максом Бергманном в 1932 году . [31] Следовательно, этот метод стал известен как синтез Бергмана-Зерваса, который был охарактеризован как «эпохальный» и помог утвердить химию синтетических пептидов в качестве отдельного направления. поле. [30] Это первый полезный лабораторный метод контролируемого синтеза пептидов, позволяющий синтезировать ранее недостижимые пептиды с реакционноспособными боковыми цепями, в то время как Z-защищенные аминокислоты также предотвращают рацемизацию . [30] [31]
Использование метода Бергмана-Зерваса оставалось стандартной практикой в химии пептидов в течение двух полных десятилетий после его публикации, а в начале 1950-х годов его заменили более новые методы (такие как Boc-защитная группа). [30] В настоящее время, хотя его периодически используют для защиты α-аминов, гораздо чаще его используют для защиты боковой цепи.
Защитная группа аллилоксикарбонила (аллока) иногда используется для защиты аминогруппы (или карбоновой кислоты, или спиртовой группы), когда требуется ортогональная схема снятия защиты. Его также иногда используют при проведении образования циклического пептида на смоле, где пептид связан со смолой функциональной группой боковой цепи. Группу Alloc можно удалить с помощью тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) . [32]
Для особых применений, таких как этапы синтеза, включающие белковые микрочипы , используются защитные группы, иногда называемые «литографическими», которые поддаются фотохимии при определенной длине волны света и поэтому могут быть удалены во время литографических операций. [33] [34] [35] [36]
Образование множества нативных дисульфидов остается проблемой синтеза нативных пептидов твердофазными методами. Случайное сочетание цепей обычно приводит к образованию нескольких продуктов с ненативными дисульфидными связями. [37] Поэтапное образование дисульфидных связей обычно является предпочтительным методом и осуществляется с использованием тиоловых защитных групп. [38] Различные тиоловые защитные группы обеспечивают различные аспекты ортогональной защиты. Эти ортогонально защищенные цистеины включаются во время твердофазного синтеза пептида. Последовательное удаление этих групп, позволяющее избирательно высвободить тиоловые группы, приводит к ступенчатому образованию дисульфида. Необходимо учитывать порядок удаления групп, чтобы одновременно удалялась только одна группа.
Тиолзащитные группы, используемые в синтезе пептидов, требующих последующего образования региоселективной дисульфидной связи, должны обладать множеством характеристик. [39] [40] Во-первых, они должны быть обратимыми в условиях, не влияющих на незащищенные боковые цепи. Во-вторых, защитная группа должна быть способна выдерживать условия твердофазного синтеза. В-третьих, если желательна ортогональная защита, удаление тиолзащитной группы должно быть таким, чтобы другие тиолзащитные группы оставались нетронутыми. То есть удаление PG A не должно влиять на PG B. Некоторые из обычно используемых тиолзащитных групп включают ацетамидометил (Acm), трет -бутил (But), 3-нитро-2-пиридинсульфенил (NPYS), 2- пиридинсульфенильная (Pyr) и тритильная (Trt) группы. [39] Важно отметить, что группа NPYS может заменять Acm PG с образованием активированного тиола. [41]
Используя этот метод, Кисо и его коллеги сообщили о первом полном синтезе инсулина в 1993 году. [42] В этой работе А-цепь инсулина была получена со следующими защитными группами на ее цистеинах: CysA6(But), CysA7(Acm ) и CysA11(Но), оставляя CysA20 незащищенным. [42]
Синтез пептидов с помощью микроволновой печи использовался для завершения длинных пептидных последовательностей с высокой степенью выхода и низкой степенью рацемизации. [43] [44]
Первая статья, посвященная синтезу пептидов в непрерывном потоке, была опубликована в 1986 году [45] , но из-за технических ограничений только в начале 2010-х годов больше академических групп начали использовать непрерывный поток для быстрого синтеза пептидов. [46] [47] Преимуществом непрерывного потока по сравнению с традиционными периодическими методами является возможность нагревать реагенты с хорошим контролем температуры, что обеспечивает скорость кинетики реакции при минимизации побочных реакций. [48] продолжительность циклов варьируется от 30 секунд до 6 минут, в зависимости от условий реакции и избытка реагента.
Благодаря встроенной аналитике, такой как УФ/Вид-спектроскопия, и использованию реактора с регулируемым потоком в слое (VBFR), который контролирует объем смолы, можно выявить агрегацию на смоле и оценить эффективность связывания. [49]
Пошаговая элонгация, при которой аминокислоты последовательно соединяются, идеально подходит для небольших пептидов, содержащих от 2 до 100 аминокислотных остатков. Другой метод — конденсация фрагментов , при которой соединяются пептидные фрагменты. [50] [51] [52] Хотя первый может удлинять пептидную цепь без рацемизации , выход падает, если его использовать только для создания длинных или высокополярных пептидов. Конденсация фрагментов лучше, чем ступенчатая элонгация, для синтеза сложных длинных пептидов, но ее использование должно быть ограничено, чтобы защитить от рацемизации. Конденсация фрагментов также нежелательна, поскольку сцепленный фрагмент должен находиться в значительном избытке, что может быть ограничением в зависимости от длины фрагмента. [53]
Новой разработкой для получения более длинных пептидных цепей является химическое лигирование : незащищенные пептидные цепи хемоселективно реагируют в водном растворе. Первый кинетически контролируемый продукт перегруппировывается с образованием амидной связи. В наиболее распространенной форме нативного химического лигирования используется пептидный тиоэфир, который реагирует с концевым остатком цистеина. [54]
Другие методы, применимые для ковалентного связывания полипептидов в водном растворе, включают использование расщепленных интеинов , [55] спонтанное образование изопептидной связи [56] и лигирование сортазы . [57]
С целью оптимизации синтеза длинных пептидов в Medicon Valley был разработан метод преобразования пептидных последовательностей . [ нужна цитация ] Простая предварительная последовательность (например, лизин (Lysn); глутаминовая кислота (Glun); (LysGlu)n), которая включается на C-конец пептида, чтобы индуцировать структуру, подобную альфа-спирали . Это потенциально может увеличить период биологического полувыведения , улучшить стабильность пептидов и ингибировать ферментативную деградацию без изменения фармакологической активности или профиля действия. [58] [59]
Пептиды могут циклизоваться на твердой подложке. Можно использовать различные реагенты циклизации, такие как HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA. [60] Пептиды типа «голова-хвост» могут быть получены на твердой подложке. Снятие защиты с С-конца в каком-либо подходящем месте делает возможной циклизацию на смоле путем образования амидной связи со снятой защитой N-конца. После завершения циклизации пептид отщепляется от смолы путем ацидолиза и очищается. [61] [62]
Стратегия твердофазного синтеза циклических пептидов не ограничивается присоединением через боковые цепи Asp, Glu или Lys. Цистеин имеет очень реакционноспособную сульфгидрильную группу на боковой цепи. Дисульфидный мостик создается, когда атом серы одного цистеина образует одинарную ковалентную связь с другим атомом серы второго цистеина в другой части белка. Эти мостики помогают стабилизировать белки, особенно те, которые секретируются клетками. Некоторые исследователи используют модифицированные цистеины с помощью S-ацетомидометила (Acm), чтобы заблокировать образование дисульфидной связи, но сохранить цистеин и исходную первичную структуру белка. [63]
Циклизация вне смолы представляет собой твердофазный синтез ключевых промежуточных продуктов, за которым следует ключевая циклизация в фазе раствора, окончательное снятие защиты с любых замаскированных боковых цепей также осуществляется в фазе раствора. Это имеет те недостатки, что эффективность твердофазного синтеза теряется на стадиях растворенной фазы, требуется очистка от побочных продуктов, реагентов и непрореагировавшего материала и что могут образовываться нежелательные олигомеры , если участвует образование макроцикла . [64]
Использование пентафторфениловых эфиров (FDPP, [65] PFPOH [66] ) и BOP-Cl [67] полезно для циклизации пептидов.
Первый защищенный пептид был синтезирован Теодором Куртиусом в 1882 году, а первый свободный пептид был синтезирован Эмилем Фишером в 1901 году. [3]