stringtranslate.com

SDS-ПААГ

Белки мембраны эритроцитов, разделенные методом SDS-PAGE по их молекулярным массам

SDS-PAGE ( электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия ) — это прерывистая электрофоретическая система, разработанная Ульрихом К. Леммли , которая обычно используется в качестве метода разделения белков с молекулярной массой от 5 до 250 кДа . [1] [2] Совместное использование додецилсульфата натрия (SDS, также известного как лаурилсульфат натрия) и полиакриламидного геля устраняет влияние структуры и заряда, а белки разделяются по разнице в их размере. По крайней мере до 2012 года публикация, описывающая ее, была наиболее часто цитируемой статьей одного автора и второй по цитируемости в целом. [3]

Характеристики

Разворачивание белка с помощью SDS
Разворачивание белка под воздействием тепла

SDS-PAGE — это метод электрофореза , позволяющий разделять белки по массе. Среда (также называемая «матрицей») представляет собой прерывистый гель на основе полиакриламида. Полиакриламидный гель обычно располагается между двумя стеклянными пластинами в пластинчатом геле. Хотя гели в трубках (в стеклянных цилиндрах) использовались исторически, они быстро устарели с изобретением более удобных пластинчатых гелей. [4] Кроме того, используется SDS ( додецилсульфат натрия ). Около 1,4 грамма SDS связываются с граммом белка, [5] [6] [7] что соответствует одному заряду молекулы SDS на две аминокислоты . [8] SDS действует как поверхностно-активное вещество , маскируя собственный заряд белка и придавая им очень похожие соотношения заряда к массе. Собственные заряды белков незначительны по сравнению с загрузкой SDS, а положительные заряды также значительно уменьшаются в основном диапазоне pH разделительного геля. При приложении постоянного электрического поля белки мигрируют к аноду, каждый с разной скоростью, в зависимости от их массы. Эта простая процедура позволяет точно разделять белки по массе.

SDS имеет тенденцию образовывать сферические мицеллы в водных растворах выше определенной концентрации, называемой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Выше критической концентрации мицеллообразования от 7 до 10 миллимоль в растворах SDS одновременно встречается в виде отдельных молекул ( мономеров ) и в виде мицелл, ниже ККМ SDS встречается только в виде мономеров в водных растворах. При критической концентрации мицеллообразования мицелла состоит примерно из 62 молекул SDS. [9] Однако только мономеры SDS связываются с белками посредством гидрофобных взаимодействий, тогда как мицеллы SDS являются анионными снаружи и не адсорбируют никаких белков. [5] SDS по своей природе амфипатичен, что позволяет ему разворачивать как полярные, так и неполярные участки структуры белка. [10] При концентрациях SDS выше 0,1 миллимоль начинается разворачивание белков, [5] а выше 1 мМ большинство белков денатурируются. [5] Из-за сильного денатурирующего эффекта SDS и последующей диссоциации белковых комплексов четвертичные структуры , как правило, не могут быть определены с помощью SDS. Исключениями являются белки, которые стабилизированы ковалентной сшивкой (например, -SS-связями) и SDS-устойчивые белковые комплексы, которые стабильны даже в присутствии SDS (последние, однако, только при комнатной температуре). Для денатурации SDS-устойчивых комплексов требуется высокая энергия активации, которая достигается нагреванием. SDS-устойчивость основана на метастабильности белковой складки. Хотя нативный, полностью свернутый, SDS-устойчивый белок не обладает достаточной стабильностью в присутствии SDS, химическое равновесие денатурации при комнатной температуре происходит медленно. Стабильные белковые комплексы характеризуются не только устойчивостью к SDS, но и устойчивостью к протеазам и увеличенным биологическим периодом полураспада . [11]

В качестве альтернативы можно также провести электрофорез в полиакриламидном геле с катионными поверхностно-активными веществами CTAB в CTAB-PAGE, [12] [13] [14] или 16-BAC в BAC-PAGE. [15]

Процедура

Метод SDS-PAGE состоит из подготовки геля, подготовки образца, электрофореза, окрашивания белков или вестерн-блоттинга и анализа полученного рисунка полос.

Производство геля

Образцы расчесок с разным количеством карманов, каждый зубец при вытаскивании оставляет карман в геле
Полимеризованный разделяющий и концентрирующий гель перед извлечением гребенки для образцов (белой) между прокладками (черными), в концентрирующем геле есть небольшое количество бромфенолового синего для улучшения видимости, разделяющий гель неокрашен

При использовании различных буферов в геле (прерывистый гель-электрофорез) гели готовятся за один день до электрофореза, чтобы диффузия не привела к смешиванию буферов. Гель получают путем свободнорадикальной полимеризации в форме, состоящей из двух герметично закрытых стеклянных пластин с прокладками между стеклянными пластинами. В типичной установке мини-геля прокладки имеют толщину 0,75 мм или 1,5 мм, что определяет нагрузочную способность геля. Для заливки раствора геля пластины обычно зажимают в подставке, которая временно герметизирует в противном случае открытую нижнюю сторону стеклянных пластин двумя прокладками. Для раствора геля акриламид смешивают в качестве гелеобразователя (обычно 4% об./об. в концентрирующем геле и 10-12% в разделяющем геле), метиленбисакриламид в качестве сшивающего агента, буфер концентрирующего или разделяющего геля, воду и SDS. При добавлении катализатора TEMED и радикального инициатора персульфата аммония (APS) начинается полимеризация. [16] Затем раствор заливается между стеклянными пластинами, не создавая пузырьков. В зависимости от количества катализатора и радикального инициатора, а также от температуры, полимеризация длится от четверти часа до нескольких часов. Сначала заливается нижний гель (разделительный гель) и покрывается несколькими каплями едва растворимого в воде спирта (обычно насыщенного буфером бутанола или изопропанола), который устраняет пузырьки из мениска и защищает гелевый раствор поглотителя радикалов кислорода. После полимеризации разделительного геля спирт выливается, а остаточный спирт удаляется фильтровальной бумагой . После добавления APS и TEMED к раствору концентрирующего геля он заливается поверх твердого разделительного геля. После этого между стеклянными пластинами вставляется подходящая гребенка для образцов, не создавая пузырьков. Гребенка для образцов осторожно вытаскивается после полимеризации, оставляя карманы для нанесения образца. Для последующего использования белков для секвенирования гели часто готовятся за день до электрофореза, чтобы уменьшить реакции неполимеризованного акриламида с цистеинами в белках.

Используя градиентный смеситель, можно отливать градиентные гели с градиентом акриламида (обычно от 4 до 12%), которые имеют больший диапазон разделения молекулярных масс. [17] Коммерческие гелевые системы (так называемые готовые гели ) обычно используют буферное вещество Bis-tris methane со значением pH от 6,4 до 7,2 как в концентрирующем геле, так и в разделяющем геле. [18] [19] Эти гели поставляются в литом виде и готовыми к использованию. Поскольку они используют только один буфер (непрерывный гель-электрофорез) и имеют почти нейтральный pH, их можно хранить в течение нескольких недель. Более нейтральный pH замедляет гидролиз и, следовательно, разложение полиакриламида. Кроме того, в белках меньше цистеинов, модифицированных акриламидом. [18] Из-за постоянного pH в собирающем и разделяющем геле эффект стекирования отсутствует. Белки в гелях BisTris не могут быть окрашены комплексами рутения. [20] Эта гелевая система имеет сравнительно большой диапазон разделения, который можно изменять, используя MES или MOPS в рабочем буфере. [18]

Подготовка образца

Восстановление дисульфида с помощью DTT

Во время подготовки образца буфер образца и, следовательно, SDS, добавляют в избытке к белкам, а затем образец нагревают до 95 °C в течение пяти минут или, альтернативно, до 70 °C в течение десяти минут. Нагревание разрушает вторичную и третичную структуры белка, разрывая водородные связи и растягивая молекулы. При желании дисульфидные мостики можно расщепить путем восстановления. Для этой цели в буфер образца добавляют восстанавливающие тиолы , такие как β-меркаптоэтанол (β-ME, 5% по объему), дитиотреитол (DTT, 10–100 миллимолей), [21] дитиоэритритол (DTE, 10 миллимолей), трис(2-карбоксиэтил)фосфин [22] или трибутилфосфин [21] . После охлаждения до комнатной температуры каждый образец пипетируют в его собственную лунку в геле, который предварительно был погружен в буфер электрофореза в электрофорезном аппарате.

В дополнение к образцам, маркер размера молекулярной массы обычно загружается в гель. Он состоит из белков известных размеров и, таким образом, позволяет оценить (с погрешностью ± 10%) размеры белков в реальных образцах, которые мигрируют параллельно в разных дорожках геля. [23] Маркер размера часто пипетируется в первый или последний карман геля.

Электрофорез

Электрофорезная камера после нескольких минут электрофореза. В первом кармане наносился маркер размера с бромфеноловым синим, в других карманах образцы были добавлены с бромкрезоловым зеленым
Электрофорезная камера после часа электрофореза при 80 Вольт. В первой и последних двух загруженных лунках был применен коммерческий белковый лейдвер. Другие загруженные лунки содержат образцы белка, покрытые SDS.

Для разделения денатурированные образцы загружаются в гель полиакриламида, который помещается в буфер электрофореза с подходящими электролитами. После этого подается напряжение (обычно около 100 В, 10-20 В на см длины геля), что вызывает миграцию отрицательно заряженных молекул через гель в направлении положительно заряженного анода . Гель действует как сито. Небольшие белки сравнительно легко мигрируют через сетку геля, в то время как более крупные белки с большей вероятностью будут удерживаться и, таким образом, медленнее мигрировать через гель, тем самым позволяя разделять белки по размеру молекул. Электрофорез длится от получаса до нескольких часов в зависимости от напряжения и длины используемого геля.

Наиболее быстро мигрирующие белки (с молекулярной массой менее 5 кДа) образуют буферный фронт вместе с анионными компонентами буфера электрофореза, которые также мигрируют через гель. Область буферного фронта становится видимой за счет добавления сравнительно небольшого анионного красителя бромфенолового синего в буфер образца. Из-за относительно небольшого размера молекулы бромфенолового синего он мигрирует быстрее белков. Благодаря оптическому контролю мигрирующей окрашенной полосы электрофорез можно остановить до того, как краситель и образцы полностью мигрируют через гель и покинут его.

Наиболее часто используемый метод — прерывистый SDS-PAGE. [24] [25] В этом методе белки сначала мигрируют в собирающий гель с нейтральным pH, в котором они концентрируются, а затем мигрируют в разделяющий гель с основным pH, в котором происходит фактическое разделение. Укладочные и разделяющие гели отличаются разным размером пор (4-6 % T и 10-20 % T), ионной силой и значениями pH (pH 6,8 или pH 8,8). Наиболее часто используемым электролитом является буферная система Tris - glycine -chloride , содержащая SDS . При нейтральном pH глицин преимущественно образует цвиттер-ионную форму, при высоком pH глицины теряют положительные заряды и становятся преимущественно анионными. В собирающем геле меньшие, отрицательно заряженные ионы хлора мигрируют перед белками (как ведущие ионы), а немного большие, отрицательно и частично положительно заряженные ионы глицината мигрируют за белками (как начальные отстающие ионы), тогда как в сравнительно основном разделяющем геле оба иона мигрируют перед белками. Градиент pH между буферами стекирующего и разделяющего гелей приводит к эффекту стекирования на границе стекирующего геля с разделяющим гелем, поскольку глицинат частично теряет свои замедляющие положительные заряды по мере увеличения pH, а затем, как бывший отстающий ион, обгоняет белки и становится ведущим ионом, что приводит к тому, что полосы различных белков (видимые после окрашивания) становятся уже и резче - эффект стекирования. Для разделения более мелких белков и пептидов используется буферная система TRIS- Tricine Шеггера и фон Ягова из-за более высокого разброса белков в диапазоне от 0,5 до 50 кДа. [26]

Окрашивание гелем

Окрашенный Кумасси 10% Трис/Трициновый гель. В левой полосе маркер размера молекулярной массы использовался для оценки размера (сверху вниз: 66, 45, 35, 24, 18 и 9 кДа). В остальных полосах были разделены очищенные дрожжевые белки.

В конце электрофоретического разделения все белки сортируются по размеру и затем могут быть проанализированы другими методами, например, окрашиванием белков, таким как окрашивание Кумасси (наиболее распространенное и простое в использовании), [27] [28] окрашиванием серебром (наивысшая чувствительность), [29] [30] [31] [32] [33] [34] окрашиванием всеми красителями, окрашиванием амидо черным 10B , [28] быстрым зеленым FCF- окрашиванием, [28] флуоресцентными красителями, такими как эпикоконон [35] и оранжевый SYPRO, [36] и иммунологическим обнаружением, таким как вестерн-блот . [37] [ 38] Флуоресцентные красители имеют сравнительно более высокую линейность между количеством белка и интенсивностью цвета, примерно на три порядка превышающую предел обнаружения (количество белка, которое можно оценить по интенсивности цвета). При использовании флуоресцентного белкового красителя трихлорэтанола последующее окрашивание белка исключается, если он был добавлен к раствору геля, а гель был облучен УФ-светом после электрофореза. [39] [40]

При окрашивании Кумасси гель фиксируют в растворе 50% этанола и 10% ледяной уксусной кислоты в течение 1 ч. Затем раствор меняют на свежий, а через 1–12 ч гель меняют на красящий раствор (50% метанол, 10% ледяная уксусная кислота, 0,1% кумасси бриллиантовый синий) с последующей отмывкой, многократно меняя отмывочный раствор из 40% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты.

Анализ

Окрашивание белков в геле создает документируемую картину полос различных белков.

Документирование рисунка полос обычно осуществляется путем фотографирования или сканирования. Для последующего извлечения молекул в отдельных полосах можно провести гель-экстракцию .

Архивирование

Два геля SDS после завершения разделения образцов и окрашивания в сушильной рамке

После окрашивания белка и документирования рисунка полос полиакриламидный гель можно высушить для архивного хранения. [43] Белки можно извлечь из него позднее. Гель помещают либо в сушильную рамку (с использованием тепла или без него), либо в вакуумную сушилку. Сушильная рама состоит из двух частей, одна из которых служит основой для влажной целлофановой пленки, к которой добавляют гель и однопроцентный раствор глицерина . Затем наносится вторая влажная целлофановая пленка без пузырьков, вторая часть рамки кладется сверху, и рамка запечатывается зажимами. Удаление пузырьков воздуха позволяет избежать фрагментации геля во время сушки. Вода испаряется через целлофановую пленку. В отличие от сушильной рамки, вакуумная сушилка создает вакуум и нагревает гель примерно до 50 °C.

Определение молекулярной массы

Белки маркера размера (черный X) показывают приблизительно прямую линию в представлении log M по Rf. Молекулярную массу неизвестного белка (красный X) можно определить по оси Y.

Для более точного определения молекулярной массы измеряют относительные расстояния миграции отдельных полос белка в разделяющем геле. [44] [45] Измерения обычно проводят трижды для повышения точности. Относительная подвижность (называемая значением Rf или значением Rm) определяется как расстояние, пройденное полосой белка, деленное на расстояние, пройденное фронтом буфера. Каждое расстояние измеряется от начала разделяющего геля. Миграция фронта буфера примерно соответствует миграции красителя, содержащегося в буфере образца. Rf маркера размера наносятся на полулогарифмический график в зависимости от их известных молекулярных масс. Путем сравнения с линейной частью сгенерированного графика или с помощью регрессионного анализа молекулярную массу неизвестного белка можно определить по его относительной подвижности. [44] [46]

Полосы белков с гликозилированием могут быть размытыми, [41] поскольку гликозилирование часто неоднородно. [47] Белки со многими основными аминокислотами (например, гистоны ) [48] могут привести к переоценке молекулярной массы или даже вообще не мигрировать в гель, потому что они движутся медленнее в электрофорезе из-за положительных зарядов или даже в противоположном направлении. С другой стороны, многие кислые аминокислоты могут привести к ускоренной миграции белка и недооценке его молекулярной массы. [49]

Приложения

SDS-PAGE в сочетании с белковым красителем широко используется в биохимии для быстрого и точного разделения и последующего анализа белков. Он имеет сравнительно низкую стоимость инструментов и реагентов и является простым в использовании методом. Из-за своей низкой масштабируемости он в основном используется в аналитических целях и меньше в препаративных целях, особенно когда необходимо выделить большие количества белка.

Кроме того, SDS-PAGE используется в сочетании с вестерн-блоттингом для определения присутствия определенного белка в смеси белков или для анализа посттрансляционных модификаций . [50] [51] Посттрансляционные модификации белков могут приводить к различной относительной подвижности (т. е. сдвигу полосы ) или к изменению связывания детектирующего антитела, используемого в вестерн-блоттинге (т. е. полоса исчезает или появляется).

В масс-спектрометрии белков SDS-PAGE является широко используемым методом подготовки образцов перед спектрометрией, в основном с использованием расщепления в геле . Что касается определения молекулярной массы белка, SDS-PAGE немного точнее аналитического ультрацентрифугирования , но менее точен, чем масс-спектрометрия или - игнорируя посттрансляционные модификации - расчет молекулярной массы белка из последовательности ДНК .

В медицинской диагностике SDS-PAGE используется как часть теста на ВИЧ и для оценки протеинурии . В тесте на ВИЧ белки ВИЧ разделяются с помощью SDS-PAGE и впоследствии определяются с помощью вестерн-блота с ВИЧ-специфическими антителами пациента, если они присутствуют в его сыворотке крови . SDS-PAGE для протеинурии оценивает уровни различных сывороточных белков в моче, например, альбумина , альфа-2-макроглобулина и IgG .

Варианты

SDS-PAGE является наиболее широко используемым методом для гель-электрофоретического разделения белков. Двумерный гель-электрофорез последовательно объединяет изоэлектрическое фокусирование или BAC-PAGE с SDS-PAGE. [52] [53] Нативный PAGE используется, если необходимо сохранить нативную укладку белка. Для разделения мембранных белков в качестве альтернативы SDS-PAGE можно использовать BAC-PAGE или CTAB-PAGE. Для электрофоретического разделения более крупных белковых комплексов можно использовать электрофорез в агарозном геле , например, SDD-AGE . Некоторые ферменты можно обнаружить по их ферментативной активности с помощью зимографии . [54]

Альтернативы

Будучи одним из наиболее точных и недорогих методов разделения и анализа белков, SDS-PAGE денатурирует белки. Когда необходимы неденатурирующие условия, белки разделяются с помощью нативного PAGE или других хроматографических методов с последующей фотометрической количественной оценкой , например, аффинной хроматографии (или даже тандемной аффинной очистки ), гель-хроматографии , ионообменной хроматографии . [55] Белки также можно разделять по размеру с помощью тангенциальной проточной фильтрации [56] или ультрафильтрации . [57] Отдельные белки можно выделять из смеси с помощью аффинной хроматографии или анализа pull-down . Некоторые исторически ранние и экономически эффективные, но грубые методы разделения обычно основаны на серии экстракций и осаждений с использованием космотропных молекул, например, осаждение сульфатом аммония и осаждение полиэтиленгликолем .

История

В 1948 году Арне Тиселиус был удостоен Нобелевской премии по химии за открытие принципа электрофореза как миграции заряженных и растворенных атомов или молекул в электрическом поле. [58] Использование твердой матрицы (первоначально бумажных дисков) в зонном электрофорезе улучшило разделение. Прерывистый электрофорез 1964 года Л. Орнштейна и Б. Дж. Дэвиса позволил улучшить разделение за счет эффекта стекирования. [59] Использование сшитых полиакриламидных гидрогелей, в отличие от ранее используемых бумажных дисков или крахмальных гелей, обеспечило более высокую стабильность геля и отсутствие микробного разложения. Денатурирующий эффект SDS в непрерывных полиакриламидных гелях и последующее улучшение разрешения были впервые описаны в 1965 году Дэвидом Ф. Саммерсом в рабочей группе Джеймса Э. Дарнелла по разделению белков полиовируса. [60] Текущий вариант SDS-PAGE был описан в 1970 году Ульрихом К. Леммли и первоначально использовался для характеристики белков в головке бактериофага Т4 . [1]

Ссылки

  1. ^ ab Laemmli, UK (1970). «Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага T4». Nature . 227 (5259): 680–685. Bibcode :1970Natur.227..680L. doi :10.1038/227680a0. ISSN  0028-0836. PMID  5432063. S2CID  3105149.
  2. ^ "Интервью с Ульрихом Леммли". Neue Zürcher Zeitung (на немецком языке). № 11. 2005 г. Проверено 4 марта 2012 г.
  3. ^ Neue Züricher Zeitung: Интервью с Ульрихом Леммли (на немецком языке). NZZ Folio, № 11, 2005 г. По состоянию на 4 марта 2012 г.
  4. ^ Studier, F (2000-12-01). "Электрофорез в пластинчатом геле". Trends in Biochemical Sciences . 25 (12). Elsevier BV: 588–590. doi :10.1016/s0968-0004(00)01679-0. ISSN  0968-0004. PMID  11116182.
  5. ^ abcd Рейнольдс, JA; Танфорд, Чарльз (1970). «Связывание додецилсульфата с белками при высоких коэффициентах связывания. Возможные последствия для состояния белков в биологических мембранах». Proc Natl Acad Sci USA . 66 (3): 1002–7. Bibcode : 1970PNAS...66.1002R. doi : 10.1073/pnas.66.3.1002 . PMC 283150. PMID  5269225. 
  6. ^ Смит, Б. Дж. (1984). "Электрофорез белков в полиакриламидном геле с SDS". Белки . Методы в молекулярной биологии. Т. 1. С. 41–56. doi :10.1385/0-89603-062-8:41. ISBN 0-89603-062-8. PMID  20512673.
  7. ^ Стайкос, Георгиос; Дондос, Анастасиос (2009). «Изучение комплексов додецилсульфата натрия–белка: доказательство их червеобразной конформации путем рассмотрения их как полимеров случайных клубков». Colloid and Polymer Science . 287 (8): 1001–1004. doi :10.1007/s00396-009-2059-3. ISSN  0303-402X. S2CID  97367384.
  8. ^ Ninfa AJ, Ballou DP, Benore M (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-470-08766-4. OCLC  420027217.
  9. ^ Turro, Nicholas J.; Yekta, Ahmad (1978). «Люминесцентные зонды для растворов моющих средств. Простая процедура определения среднего числа агрегации мицелл». Журнал Американского химического общества . 100 (18): 5951–5952. doi :10.1021/ja00486a062. ISSN  0002-7863.
  10. ^ Берг, Джереми М. (2015-04-08). Биохимия . Тимочко, Джон Л.; Гатто, Грегори Дж. Мл.; Страйер, Луберт (восьмое изд.). Нью-Йорк. ISBN 9781464126109. OCLC  913469736.{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )
  11. ^ Manning M, Colón W (2004). «Структурная основа кинетической стабильности белка: устойчивость к додецилсульфату натрия предполагает центральную роль жесткости и смещение в сторону структуры бета-слоя». Биохимия . 43 (35): 11248–54. doi :10.1021/bi0491898. PMID  15366934.
  12. ^ Буксбаум, Энгельберт (2003). «Катионный электрофорез и электроперенос мембранных гликопротеинов». Аналитическая биохимия . 314 (1): 70–76. doi :10.1016/S0003-2697(02)00639-5. ISSN  0003-2697. PMID  12633604.
  13. ^ Акин, Дайан Т.; Шапира, Рэймонд; Кинкейд, Джозеф М. (1985). «Определение молекулярных масс биологически активных белков электрофорезом в полиакриламидном геле с бромидом цетилтриметиламмония». Аналитическая биохимия . 145 (1): 170–176. doi :10.1016/0003-2697(85)90343-4. ISSN  0003-2697. PMID  4003759.
  14. ^ Симпсон, Р. Дж. (2010). "CTAB-PAGE". Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (4): pdb.prot5412. doi :10.1101/pdb.prot5412. ISSN  1559-6095. PMID  20360366.
  15. ^ Хартингер, Иоахим; Стениус, Катинка; Хёгеманн, Дагмар; Ян, Рейнхард (1996). «16-BAC/SDS–PAGE: система двумерного гель-электрофореза, подходящая для разделения интегральных мембранных белков». Аналитическая биохимия . 240 (1): 126–133. doi : 10.1006/abio.1996.0339 . ISSN  0003-2697. PMID  8811889.
  16. ^ JL Brunelle, R. Green: Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле с SDS (1D SDS-PAGE). В: Методы в энзимологии. Том 541, 2014, стр. 151–159, doi :10.1016/B978-0-12-420119-4.00012-4, PMID 24674069.
  17. ^ Margolis J, Kenrick KG (1969). «Двумерное разрешение плазменных белков с помощью комбинации полиакриламидного диска и градиентного гель-электрофореза». Nature . 221 (5185): 1056–7. Bibcode :1969Natur.221.1056M. doi :10.1038/2211056a0. PMID  5774398. S2CID  4197850.
  18. ^ abc Hachmann, John P.; Amshey, Joseph W. (2005). «Модели модификации белков в гелях Tris–glycine и Bis–Tris с нейтральным pH во время электрофореза: влияние pH геля». Аналитическая биохимия . 342 (2): 237–245. doi :10.1016/j.ab.2005.04.015. ISSN  0003-2697. PMID  15935323.
  19. ^ Вилтфанг, Йенс; Арольд, Норберт; Нойхофф, Фолькер (1991). «Новая многофазная буферная система для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для белков и пептидов с молекулярными массами 100 000-1000 и их обнаружение с пикомолярной чувствительностью». Электрофорез . 12 (5): 352–366. doi :10.1002/elps.1150120507. ISSN  0173-0835. PMID  1718736. S2CID  40101706.
  20. ^ Moebius, Jan; Denker, Katrin; Sickmann, Albert (2007). «Рутений (II) трис-батофенантролин дисульфонат хорошо подходит для трис-глицинового электрофореза в полиакриламидном геле, но не для бис-трис-гелей». Proteomics . 7 (4): 524–527. doi :10.1002/pmic.200600642. ISSN  1615-9853. PMID  17309097. S2CID  25822873.
  21. ^ ab Breyer Woodland, Aleksandar Necakov, Jens R. Coorssen: Оптимизированная редукция протеома для интегративной нисходящей протеомики. В: Proteomes. 2023, Band 11, Nummer 1, S. 10 doi :10.3390/proteomes11010010. PMID 36976889. PMC  10059017.
  22. ^ Джон А. Бернс, Джеймс С. Батлер, Джон Т. Моран, Джордж М. Уайтсайдс: Селективное восстановление дисульфидов трис(2-карбоксиэтил)фосфином. В: Журнал органической химии. 1991, Band 56, Nummer 8, S. 2648–2650 doi :10.1021/jo00008a014.
  23. ^ Розенберг, Ян М. (22 декабря 2006 г.). Анализ и очистка белков: настольные методы. Springer Science & Business Media. стр. 103–. ISBN 978-0-8176-4412-3.
  24. ^ E. Buxbaum: Катионный электрофорез. В: Методы молекулярной биологии. Том 1855, 2019, стр. 115–124, doi :10.1007/978-1-4939-8793-1_12, PMID 30426413.
  25. ^ Л. Бэкман, К. Перссон: Безошибочный SDS-PAGE. В: Методы в молекулярной биологии. Том 1721, 2018, стр. 89–94, doi :10.1007/978-1-4939-7546-4_8, PMID 29423849.
  26. ^ Шеггер, Герман; фон Ягов, Гебхард (1987). «Электрофорез в полиакриламидном геле с трицин-додецилсульфатом натрия для разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа». Аналитическая биохимия . 166 (2): 368–379. doi :10.1016/0003-2697(87)90587-2. ISSN  0003-2697. PMID  2449095.
  27. ^ Fazekas de St. Groth, S.; Webster, RG; Datyner, A. (1963). «Две новые процедуры окрашивания для количественной оценки белков на электрофоретических полосках». Biochimica et Biophysica Acta . 71 : 377–391. doi :10.1016/0006-3002(63)91092-8. PMID  18421828.
  28. ^ abc Wilson, CM (1979). «Исследования и критика Amido Black 10B, Coomassie Blue R и Fast Green FCF в качестве красителей для белков после электрофореза в полиакриламидном геле». Anal Biochem . 96 (2): 263–78. doi :10.1016/0003-2697(79)90581-5. PMID  89822.
  29. ^ Merril, CR; Switzer, RC; Keuren, ML Van (1979). «Следы полипептидов в клеточных экстрактах и ​​жидкостях человеческого организма, обнаруженные с помощью двумерного электрофореза и высокочувствительного серебряного окрашивания». Proc Natl Acad Sci USA . 76 (9): 4335–4339. Bibcode :1979PNAS...76.4335M. doi : 10.1073/pnas.76.9.4335 . PMC 411569 . PMID  92027. 
  30. ^ RC Switzer, CR Merril, S. Shifrin (сентябрь 1979 г.), «Высокочувствительное серебряное пятно для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях», Anal Biochem (на немецком языке), т. 98, № 1, стр. 231–237, doi :10.1016/0003-2697(79)90732-2, PMID  94518{{citation}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  31. ^ Blum, H.; Beier, H.; Gross, HJ (1987). «Улучшенное окрашивание серебром растительного белка, РНК и ДНК в гелях PAA». Электрофорез . 8 : 93–99. doi :10.1002/elps.1150080203. S2CID  84471792.
  32. ^ Rabilloud, T.; et al. (1988). «Улучшение и упрощение низкофонового серебряного окрашивания белков с использованием дитионита натрия». Электрофорез . 9 (6): 288–291. doi :10.1002/elps.1150090608. PMID  2466660. S2CID  33007991.
  33. ^ Rabilloud, T. (1992). «Сравнение низкофоновых белковых пятен диаммина серебра и нитрата серебра». Электрофорез . 13 (7): 429–439. doi :10.1002/elps.1150130190. PMID  1425556. S2CID  43084621.
  34. ^ Lelong, C.; Chevallet, M.; Luche, S.; Rabilloud, T. (2009). «Окрашивание серебряным раствором белков в 2DE-гелях». Протоколы двумерного электрофореза (PDF) . Методы Mol Biol. Т. 519. стр. 339–350. doi :10.1007/978-1-59745-281-6_21. ISBN 978-1-58829-937-6. PMID  19381593. S2CID  52820065.
  35. ^ Мориц, Кристиан П.; Марц, Сабрина Х.; Рейсс, Ральф; Шуленборг, Томас; Фриауф, Экхард (февраль 2014 г.). «Окрашивание эпикокононом: мощный контроль загрузки для вестерн-блотов». Протеомика . 14 (2–3): 162–8. doi :10.1002/pmic.201300089. PMID  24339236. S2CID  206368546.
  36. ^ Демченко, Александр Петрович (2011). Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology III: Applications in Sensing and Imaging Band 3 из Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology . Springer. ISBN 978-3-642-18035-4.
  37. ^ Галлахер, Шон; Чакаварти, Деб (2008). «Окрашивание белков в гелях». Журнал визуализированных экспериментов (17). doi :10.3791/760. ISSN  1940-087X. PMC 3253607. PMID 19066521  . 
  38. ^ Wilson, CM (1983). «Окрашивание белков в гелях: сравнение красителей и процедур». Структура фермента Часть I. Методы Enzymol. Т. 91. С. 236–47. doi :10.1016/s0076-6879(83)91020-0. ISBN 9780121819910. PMID  6190068.
  39. ^ Ladner CL, Yang J, Turner RJ, Edwards RA (2004). «Видимое флуоресцентное обнаружение белков в полиакриламидных гелях без окрашивания». Anal Biochem . 326 (1): 13–20. doi :10.1016/j.ab.2003.10.047. PMID  14769330.
  40. ^ Gilda JE, Gomes AV (2013). «Окрашивание общего белка без окрашивания — превосходный контроль нагрузки по сравнению с β-актином для вестерн-блоттинга». Anal Biochem . 440 (2): 186–8. doi :10.1016/j.ab.2013.05.027. PMC 3809032. PMID  23747530 . 
  41. ^ ab Cryo-EM Часть A: Подготовка образцов и сбор данных. Academic Press. 30 сентября 2010 г. стр. 28. ISBN 978-0-08-095695-4.
  42. ^ Берджесс, Ричард Р.; Дойчер, Мюррей П. (3 ноября 2009 г.). Руководство по очистке белков. Academic Press. стр. 184–. ISBN 978-0-08-092317-8.
  43. ^ S. Stamova, I. Michalk, H. Bartsch, M. Bachmann: Методы сушки геля. В: Методы в молекулярной биологии. Том 869, 2012, стр. 433–436, doi :10.1007/978-1-61779-821-4_36, PMID 22585507.
  44. ^ ab Bonner, Philip LR; Hargreaves, Alan J. (24 августа 2011 г.). Basic Bioscience Laboratory Techniques: A Pocket Guide. John Wiley & Sons. стр. 140–. ISBN 978-1-119-95644-0.
  45. ^ Хольцхауэр, Мартин (13 сентября 2006 г.). Основные методы для биохимической лаборатории. Springer Science & Business Media. стр. 243–. ISBN 978-3-540-32786-8.
  46. ^ Капретт, Дэвид Р. (5 января 2007 г.). «Измерение подвижности белковых полос». www.ruf.rice.edu .
  47. ^ "Руководство для начинающих по гликозилированию белков". Peak Proteins . 25 февраля 2021 г.
  48. ^ van Venrooij, WJ; Maini, Ravinder N. (6 декабря 2012 г.). Руководство по биологическим маркерам заболеваний. Springer Science & Business Media. стр. 50–. ISBN 978-94-011-1670-1.
  49. ^ Guan, Yihong; Zhu, Qinfang; Huang, Delai; et al. (2015). "Уравнение для оценки разницы между теоретически предсказанными и отображаемыми в SDS PAGE молекулярными массами для кислого пептида". Scientific Reports . 5 (1): 13370. Bibcode :2015NatSR...513370G. doi :10.1038/srep13370. ISSN  2045-2322. PMC 4550835 . PMID  26311515. 
  50. ^ Mahmood T, Yang PC (сентябрь 2012 г.). «Вестерн-блот: техника, теория и устранение неполадок». North American Journal of Medical Sciences . 4 (9): 429–434. doi : 10.4103/1947-2714.100998 (неактивен 1 ноября 2024 г.). PMC 3456489. PMID  23050259 . {{cite journal}}: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2024 г. ( ссылка )
  51. ^ Бегум Х., Муругесан П., Тангутур АД. (июнь 2022 г.). «Вестерн-блоттинг: мощный метод научных и биомедицинских исследований». BioTechniques . 73 (1): 58–69. doi : 10.2144/btn-2022-0003 . PMID  35775367. S2CID  250175915.
  52. ^ O'Farrell, PH (1975). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения». J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754. PMID  236308 . 
  53. ^ Клозе, Дж. (1975). «Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мышей. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих» . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID  1093965. S2CID  30981877.
  54. ^ Вандоорен Дж., Гертс Н., Мартенс Э., Ван ден Стин П.Е., Опденаккер Г. (2013). «Зимографические методы визуализации гидролитических ферментов». Нат-методы . 10 (3): 211–220. дои : 10.1038/nmeth.2371. PMID  23443633. S2CID  5314901.
  55. ^ Янсон, Ян-Кристер (3 января 2012 г.). Очистка белков: принципы, методы высокого разрешения и приложения . John Wiley & Sons. ISBN 978-1-118-00219-3.
  56. ^ Десаи, Мохамед А. (2000). Последовательная обработка белков: методы и протоколы . Springer Science & Business Media. стр. 35. ISBN 978-1-59259-027-8.
  57. ^ Раджа, Гош (11 июня 2003 г.). Биоразделение белков с использованием ультрафильтрации: теория, применение и новые разработки . World Scientific. стр. 142. ISBN 978-1-78326-126-0.
  58. ^ Педерсон, Т. (2007). «Переворачивая страницу: ночная сенсация электрофореза в полиакриламидном геле SDS». Журнал FASEB . 22 (4): 949–953. doi : 10.1096/fj.08-0402ufm . ISSN  0892-6638. PMID  18378803. S2CID  33466516.
  59. ^ Орнштейн, Л.; Дэвис, Б.Дж. (1964). «Дискоэлектрофорез –1. Предпосылки и теория». Ann NY Acad Sci . 121 (2): 321–349. Bibcode : 1964NYASA.121..321O. doi : 10.1111/j.1749-6632.1964.tb14207.x. PMID  14240533. S2CID  28591995.
  60. ^ Summers DF, Maizel JV, Darnell JE (1965). «Доказательства наличия вирусспецифических некапсидных белков в клетках HeLa, инфицированных полиовирусом». Proc Natl Acad Sci USA . 54 (2): 505–13. Bibcode : 1965PNAS...54..505S. doi : 10.1073 /pnas.54.2.505 . PMC 219696. PMID  4285933. 

Внешние ссылки