Иммунопреципитация ( ИП ) — это метод осаждения белкового антигена из раствора с использованием антитела , которое специфически связывается с этим конкретным белком. Этот процесс можно использовать для выделения и концентрирования определенного белка из образца, содержащего многие тысячи различных белков. Иммунопреципитация требует, чтобы антитело было связано с твердым субстратом в какой-то момент процедуры.
Подразумевает использование антитела, специфичного для известного белка , для выделения этого конкретного белка из раствора, содержащего много разных белков. Эти растворы часто будут в форме сырого лизата растительной или животной ткани. Другими типами образцов могут быть жидкости организма или другие образцы биологического происхождения.
Иммунопреципитация целых белковых комплексов (т. е. антигена вместе с любыми белками или лигандами, которые связаны с ним) известна как коиммунопреципитация (Co-IP). Co-IP работает путем выбора антитела, нацеленного на известный белок, который, как полагают, является членом более крупного комплекса белков. Нацеливая этого известного члена с помощью антитела, можно извлечь весь белковый комплекс из раствора и тем самым идентифицировать неизвестные члены комплекса.
Это работает, когда белки, участвующие в комплексе, прочно связываются друг с другом, что позволяет вытащить несколько членов комплекса из раствора, зацепившись за одного члена антителом. Эта концепция вытягивания белковых комплексов из раствора иногда называется «pull-down». Co-IP — это мощный метод, который регулярно используется молекулярными биологами для анализа белок-белковых взаимодействий .
Иммунопреципитация хроматина (ChIP) — это метод, используемый для определения местоположения участков связывания ДНК в геноме для конкретного белка, представляющего интерес. Этот метод дает картину взаимодействий белок-ДНК, которые происходят внутри ядра живых клеток или тканей. Природа этого метода in vivo отличается от других подходов, традиционно используемых для ответа на те же вопросы.
Принцип, лежащий в основе этого анализа, заключается в том, что ДНК-связывающие белки (включая факторы транскрипции и гистоны ) в живых клетках могут быть сшиты с ДНК, которую они связывают. Используя антитело, специфичное к предполагаемому ДНК-связывающему белку, можно иммунопреципитировать комплекс белок-ДНК из клеточных лизатов. Сшивание часто осуществляется путем нанесения формальдегида на клетки (или ткань), хотя иногда выгоднее использовать более определенный и последовательный сшивающий агент, такой как диметил 3,3′-дитиобиспропионимидат-2 HCl (DTBP). [1] После сшивания клетки лизируются, и ДНК разбивается на части длиной 0,2–1,0 кб с помощью ультразвука . На этом этапе выполняется иммунопреципитация, приводящая к очистке комплексов белок-ДНК. Затем очищенные комплексы белок-ДНК нагреваются для отмены формальдегидного сшивания комплексов белка и ДНК, что позволяет отделить ДНК от белков. Идентичность и количество выделенных фрагментов ДНК затем можно определить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ограничением проведения ПЦР на выделенных фрагментах является то, что необходимо иметь представление о том, какой геномный регион является целевым, чтобы сгенерировать правильные праймеры ПЦР. Иногда это ограничение обходят просто клонированием выделенной геномной ДНК в плазмидный вектор , а затем использованием праймеров, специфичных для клонируемого региона этого вектора. В качестве альтернативы, когда требуется найти, где белок связывается в масштабе всего генома, используется ChIP-секвенирование , которое недавно стало стандартной технологией, которая может локализовать сайты связывания белка высокопроизводительным и экономически эффективным способом, что также позволяет характеризовать цистром . Ранее также использовался ДНК-микрочип ( ChIP-on-chip или ChIP-chip ).
RIP и CLIP очищают специфический РНК-связывающий белок для идентификации связанных РНК, тем самым изучая рибонуклеопротеины (РНП). [2] [3] В RIP совместно очищенные РНК извлекаются, и их обогащение сравнивается с контролем, что изначально делалось с помощью микрочипов или ОТ-ПЦР . В CLIP клетки подвергаются УФ-сшивке перед лизисом, после чего следуют дополнительные этапы очистки помимо стандартной иммунопреципитации, включая частичную фрагментацию РНК, промывку с высоким содержанием соли, разделение в SDS-PAGE и перенос через мембрану, а также идентификацию прямых участков связывания РНК с помощью секвенирования кДНК .
Одним из основных технических препятствий иммунопреципитации является большая сложность в создании антитела, которое специфически нацелено на один известный белок. Чтобы обойти это препятствие, многие группы конструируют метки либо на C-, либо на N-конце интересующего белка. Преимущество здесь в том, что одну и ту же метку можно использовать снова и снова на многих разных белках, и исследователь может использовать одно и то же антитело каждый раз. Преимущества использования меченых белков настолько велики, что эта техника стала обычным явлением для всех типов иммунопреципитации, включая все типы IP, описанные выше. Примерами используемых меток являются метка зеленого флуоресцентного белка (GFP), метка глутатион-S-трансферазы (GST) и метка FLAG-tag . Хотя использование метки для включения pulldowns удобно, оно вызывает некоторые опасения относительно биологической значимости, поскольку сама метка может либо скрывать нативные взаимодействия, либо вносить новые и неестественные взаимодействия.
Двумя основными методами иммунопреципитации являются метод прямого захвата и метод непрямого захвата.
Антитела, специфичные для определенного белка (или группы белков), иммобилизуются на твердофазном субстрате, таком как суперпарамагнитные микрошарики или на микроскопических агарозных (немагнитных) шариках. Шарики со связанными антителами затем добавляются в белковую смесь, и белки, на которые нацелены антитела, захватываются шариками с помощью антител; другими словами, они становятся иммунопреципитированными.
Антитела, специфичные для определенного белка или группы белков, добавляются непосредственно в смесь белков. Антитела еще не прикреплены к твердофазному носителю. Антитела могут свободно плавать вокруг смеси белков и связывать свои цели. Со временем к смеси антител и белков добавляются бусины, покрытые белком A/G . В этот момент антитела, которые теперь связаны со своими целями, прилипнут к бусинам.
С этого момента прямые и непрямые протоколы сходятся, поскольку образцы теперь имеют одинаковые ингредиенты. Оба метода дают одинаковый конечный результат с белком или белковыми комплексами, связанными с антителами, которые сами иммобилизованы на шариках.
Непрямой подход иногда предпочтительнее, когда концентрация целевого белка низкая или когда специфическое сродство антитела к белку слабое. Непрямой метод также используется, когда кинетика связывания антитела с белком медленная по разным причинам. В большинстве ситуаций прямой метод является выбором по умолчанию и предпочтительным выбором.
Исторически твердофазная подложка для иммунопреципитации, используемая большинством ученых, представляла собой высокопористые агарозные шарики (также известные как агарозные смолы или суспензии). Преимуществом этой технологии является очень высокая потенциальная связывающая способность, поскольку практически вся губчатая структура агарозной частицы (размером от 50 до 150 мкм) доступна для связывания антител (которые, в свою очередь, связывают целевые белки), а также использование стандартного лабораторного оборудования для всех аспектов протокола IP без необходимости использования какого-либо специализированного оборудования. Преимущество чрезвычайно высокой связывающей способности должно быть тщательно сбалансировано с количеством антител, которое исследователь готов использовать для покрытия агарозных шариков. Поскольку антитела могут быть фактором, ограничивающим стоимость, лучше всего производить обратный расчет от количества белка, которое необходимо захватить (в зависимости от анализа, который будет проводиться ниже по потоку), к количеству антител, которое требуется для связывания этого количества белка (с небольшим избытком, добавленным для учета неэффективности системы), и еще дальше назад к количеству агарозы, которое необходимо для связывания этого конкретного количества антител. В случаях, когда насыщение антителами не требуется, эта технология не имеет себе равных по своей способности захватывать чрезвычайно большие количества захваченных целевых белков. Оговорка здесь заключается в том, что «преимущество высокой емкости» может стать «недостатком высокой емкости» , который проявляется, когда огромная связывающая способность сефарозных /агарозных гранул не полностью насыщена антителами. Часто случается, что количество антител, доступное исследователю для их эксперимента по иммунопреципитации, недостаточно для насыщения агарозных гранул, которые будут использоваться в иммунопреципитации. В этих случаях исследователь может получить частицы агарозы, которые лишь частично покрыты антителами, а часть связывающей способности агарозных гранул, которая не покрыта антителами, затем может свободно связывать все, что прилипнет, что приводит к повышенному фоновому сигналу из-за неспецифического связывания компонентов лизата с гранулами, что может затруднить интерпретацию данных. Хотя некоторые могут утверждать, что по этим причинам разумно сопоставлять количество агарозы (с точки зрения связывающей способности) с количеством антител, которые необходимо связать для иммунопреципитации, простой способ уменьшить проблему неспецифического связывания с агарозными гранулами и повысить специфичность — это предварительно очистить лизат, что настоятельно рекомендуется для любой иммунопреципитации. [4] [5]
Лизаты представляют собой сложные смеси белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот, и следует предположить, что некоторое количество неспецифического связывания с антителом IP, белком A/G или подложкой из бусинок будет иметь место и отрицательно влиять на обнаружение иммунопреципитированной цели(ей). В большинстве случаев предварительная очистка лизата в начале каждого эксперимента по иммунопреципитации (см. шаг 2 в разделе «протокол» ниже) [6] является способом удаления потенциально реактивных компонентов из клеточного лизата до иммунопреципитации, чтобы предотвратить неспецифическое связывание этих компонентов с бусинами IP или антителом. Основная процедура предварительной очистки описана ниже, при этом лизат инкубируется только с бусинами, которые затем удаляются и выбрасываются перед иммунопреципитацией. [6] Однако этот подход не учитывает неспецифическое связывание с антителом IP, которое может быть значительным. Таким образом, альтернативный метод предварительной очистки заключается в инкубации белковой смеси с точно такими же компонентами, которые будут использоваться в иммунопреципитации, за исключением того, что вместо самого антитела IP используется нецелевое, нерелевантное антитело того же подкласса антител, что и антитело IP. [5] Этот подход пытается использовать максимально близкие к точным условиям и компонентам IP условия и компоненты фактической иммунопреципитации для удаления любого неспецифического компонента клетки без захвата целевого белка (если, конечно, целевой белок не связывается неспецифически с каким-либо другим компонентом IP, что должно надлежащим образом контролироваться путем анализа отброшенных шариков, используемых для предварительной очистки лизата). Затем целевой белок может быть иммунопреципитирован с уменьшенным риском неспецифического связывания, мешающего интерпретации данных.
Хотя подавляющее большинство иммунопреципитаций выполняется с использованием агарозных шариков, использование суперпарамагнитных шариков для иммунопреципитации является новым подходом, который набирает популярность в качестве альтернативы агарозным шарикам для приложений IP. В отличие от агарозы, магнитные шарики являются твердыми и могут быть сферическими, в зависимости от типа шарика, а связывание антител ограничивается поверхностью каждого шарика. Хотя эти шарики не имеют преимущества пористого центра для увеличения связывающей способности, магнитные шарики значительно меньше, чем агарозные шарики (от 1 до 4 мкм), и большее количество магнитных шариков на объем, чем агарозные шарики, в совокупности дает магнитным шарикам эффективное соотношение площади поверхности к объему для оптимального связывания антител.
Коммерчески доступные магнитные шарики можно разделить на основе однородности размера на монодисперсные и полидисперсные шарики. Монодисперсные шарики, также называемые микрошарики , демонстрируют точную однородность, и поэтому все шарики демонстрируют идентичные физические характеристики, включая связывающую способность и уровень притяжения к магнитам. Полидисперсные шарики, хотя и похожи по размеру на монодисперсные шарики, демонстрируют широкий диапазон изменчивости размера (от 1 до 4 мкм), что может влиять на их связывающую способность и магнитный захват. Хотя оба типа шариков коммерчески доступны для приложений иммунопреципитации, более качественные монодисперсные суперпарамагнитные шарики более идеальны для автоматических протоколов из-за их постоянного размера, формы и производительности. Монодисперсные и полидисперсные суперпарамагнитные шарики предлагаются многими компаниями, включая Invitrogen , Thermo Scientific и Millipore .
Сторонники магнитных шариков утверждают, что шарики демонстрируют более высокую скорость связывания белка [7] [8] [9] по сравнению с агарозными шариками для иммунопреципитации, хотя стандартные иммунопреципитации на основе агарозных шариков были выполнены за 1 час. [5] Также были сделаны заявления о том, что магнитные шарики лучше подходят для иммунопреципитации чрезвычайно больших белковых комплексов из-за полного отсутствия верхнего предела размера для таких комплексов, [7] [8] [10] хотя нет никаких беспристрастных доказательств, подтверждающих это утверждение. Природа технологии магнитных шариков действительно приводит к меньшей обработке образцов [8] из-за сниженной физической нагрузки на образцы магнитного разделения по сравнению с повторным центрифугированием при использовании агарозы, что может в значительной степени способствовать увеличению выхода лабильных (хрупких) белковых комплексов. [8] [9] [10] Однако при выборе поддержки иммунопреципитации следует учитывать дополнительные факторы, такие как связывающая способность, стоимость реагента, потребность в дополнительном оборудовании и возможность автоматизации процессов ИП.
Сторонники как агарозных, так и магнитных шариков могут спорить, говорит ли огромная разница в связывающей способности двух шариков в пользу одного конкретного типа шариков. При сравнении шариков агарозные шарики имеют значительно большую площадь поверхности и, следовательно, большую связывающую способность, чем магнитные шарики из-за большого размера шариков и губчатой структуры. Но переменный размер пор агарозы обуславливает потенциальный верхний предел размера, который может повлиять на связывание чрезвычайно больших белков или белковых комплексов с внутренними сайтами связывания, и поэтому магнитные шарики могут лучше подходить для иммунопреципитации больших белков или белковых комплексов, чем шарики агарозы, хотя отсутствуют независимые сравнительные доказательства, подтверждающие любой из этих случаев.
Некоторые утверждают, что значительно большая связывающая способность агарозных шариков может быть недостатком из-за большей способности неспецифического связывания. Другие могут выступать за использование магнитных шариков из-за большего количества антител, необходимых для насыщения общей связывающей способности агарозных шариков, что, очевидно, было бы экономическим недостатком использования агарозы. Хотя эти аргументы верны вне контекста их практического использования, эти линии рассуждений игнорируют два ключевых аспекта принципа иммунопреципитации, который демонстрирует, что решение использовать агарозные или магнитные шарики определяется не просто связывающей способностью.
Во-первых, неспецифическое связывание не ограничивается сайтами связывания антител на иммобилизованной подложке; любая поверхность антитела или компонента реакции иммунопреципитации может связываться с неспецифическими компонентами лизата, и поэтому неспецифическое связывание все равно будет происходить даже при использовании полностью насыщенных гранул. Вот почему важно предварительно очистить образец перед проведением иммунопреципитации.
Во-вторых, способность захватывать целевой белок напрямую зависит от количества используемого иммобилизованного антитела, и поэтому при параллельном сравнении иммунопреципитации с агарозой и магнитными частицами максимальный белок, который может захватить любая подложка, ограничен количеством добавленных антител. Поэтому решение о насыщении любого типа подложки зависит от необходимого количества белка, как описано выше в разделе Агароза на этой странице.
Цена использования любого типа подложки является ключевым определяющим фактором при использовании агарозных или магнитных шариков для иммунопреципитации. Типичный поверхностный расчет стоимости магнитных шариков по сравнению с сефарозными шариками может сделать так, что сефарозные шарики покажутся менее дорогими. Но магнитные шарики могут быть конкурентоспособными по цене по сравнению с агарозными для иммунопреципитации в аналитическом масштабе в зависимости от используемого метода ИП и объема шариков, необходимых для реакции ИП.
При использовании традиционного пакетного метода иммунопреципитации, как указано ниже, когда все компоненты добавляются в пробирку во время реакции IP, физические характеристики обработки агарозных шариков требуют минимального количества шариков для каждого эксперимента IP (обычно в диапазоне от 25 до 50 мкл шариков на IP). Это связано с тем, что сефарозные шарики должны концентрироваться на дне пробирки путем центрифугирования, а супернатант удаляться после каждой инкубации, промывки и т. д. Это накладывает абсолютные физические ограничения на процесс, поскольку осадки агарозных шариков объемом менее 25–50 мкл трудно, если не невозможно, визуально идентифицировать на дне пробирки. При использовании магнитных шариков минимального количества шариков не требуется из-за магнитной обработки, и поэтому, в зависимости от целевого антигена и антитела IP, можно использовать значительно меньше магнитных шариков.
Наоборот, спин-колонки могут использоваться вместо обычных микроцентрифужных пробирок, чтобы значительно сократить количество агарозных шариков, необходимых для реакции. Спин-колонки содержат фильтр, который позволяет всем компонентам IP, за исключением шариков, проходить через них с помощью кратковременного центрифугирования и, следовательно, обеспечивает метод использования значительно меньшего количества агарозных шариков с минимальными потерями.
Как упоминалось выше, для использования агарозных шариков в иммунопреципитации требуется только стандартное лабораторное оборудование, в то время как для реакций IP на основе магнитных шариков требуются мощные магниты. Хотя оборудование для магнитного захвата может быть дорогостоящим, быстрое завершение иммунопреципитации с использованием магнитных шариков может быть финансово выгодным подходом, когда наступают сроки грантов, поскольку 30-минутный протокол с магнитными шариками по сравнению с ночной инкубацией при 4 °C с агарозными шариками может привести к получению большего количества данных за более короткий промежуток времени. [7] [8] [9]
Дополнительным преимуществом использования магнитных шариков является то, что автоматизированные устройства иммунопреципитации становятся все более доступными. Эти устройства не только сокращают объем работы и время выполнения ИП, но и могут использоваться для приложений с высокой пропускной способностью .
Хотя явные преимущества использования магнитных шариков включают повышенную скорость реакции, более бережное обращение с образцами и потенциал для автоматизации, выбор использования агарозы или магнитных шариков на основе связывающей способности поддерживающей среды и стоимости продукта может зависеть от интересующего белка и используемого метода IP. Как и во всех анализах, требуется эмпирическое тестирование, чтобы определить, какой метод является оптимальным для данного приложения.
После выбора технологии твердых субстратных гранул антитела связываются с гранулами, а покрытые антителами гранулы можно добавлять к гетерогенному образцу белка (например, гомогенизированной ткани). На этом этапе антитела, иммобилизованные на гранулах, связываются с белками, которые они специфически распознают. Как только это произошло, иммунопреципитационная часть протокола фактически завершена, поскольку специфические интересующие белки связываются с антителами, которые сами иммобилизованы на гранулах. Отделение иммунокомплексов от лизата является чрезвычайно важной серией шагов, поскольку белок(и) должны оставаться связанными друг с другом (в случае co-IP) и связанными с антителом во время этапов промывки для удаления несвязанных белков и снижения фона.
При работе с агарозными гранулами гранулы необходимо осадить из образца путем кратковременного вращения в центрифуге с усилиями от 600 до 3000 g (умноженными на стандартную силу тяжести). Этот этап можно выполнить в стандартной микроцентрифужной пробирке, но для более быстрого разделения, большей согласованности и более высокого извлечения процесс часто выполняется в небольших спин-колонках с размером пор, который позволяет жидкости, но не агарозным гранулам проходить через них. После центрифугирования агарозные гранулы образуют очень рыхлый пушистый осадок на дне пробирки. Супернатант, содержащий загрязняющие вещества, можно осторожно удалить, чтобы не потревожить гранулы. Затем к гранулам можно добавить промывочный буфер, и после смешивания гранулы снова разделяются центрифугированием.
При использовании суперпарамагнитных шариков образец помещают в магнитное поле, чтобы шарики могли собраться на стенке пробирки. Эта процедура обычно завершается примерно за 30 секунд, а оставшаяся (нежелательная) жидкость отсасывается пипеткой. Промывка выполняется путем ресуспендирования шариков (вне магнита) с помощью промывочного раствора, а затем концентрирования шариков обратно на стенке пробирки (путем помещения пробирки обратно на магнит). Промывка обычно повторяется несколько раз, чтобы обеспечить адекватное удаление загрязнений. Если суперпарамагнитные шарики однородны по размеру и магнит был спроектирован правильно, шарики будут равномерно концентрироваться на стенке пробирки, и промывочный раствор можно будет легко и полностью удалить.
После промывки осажденный белок(ы) элюируют и анализируют с помощью гель-электрофореза , масс-спектрометрии , вестерн-блоттинга или любого другого метода для идентификации компонентов в комплексе. Время протокола для иммунопреципитации сильно варьируется из-за различных факторов, при этом время протокола увеличивается с количеством необходимых промывок или с более медленной кинетикой реакции пористых агарозных гранул.
Коиммунопреципитация (Co-IP) Техническая