Smads (или SMADs ) включают семейство структурно сходных белков , которые являются основными преобразователями сигналов для рецепторов суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-B), которые критически важны для регуляции развития и роста клеток. Аббревиатура относится к гомологиям генов Caenorhabditis elegans SMA («маленький» фенотип червей) и семейства MAD («Матери против декапентаплегики») у дрозофилы .
Существует три различных подтипа Smads: Smads, регулируемые рецепторами ( R-Smads ), Smads с общим партнером (Co-Smads) и ингибирующие Smads ( I-Smads ). Восемь членов семьи Смад разделены на эти три группы. Тримеры двух SMAD, регулируемых рецепторами, и одного co-SMAD действуют как факторы транскрипции , которые регулируют экспрессию определенных генов. [1] [2]
R-Smads состоят из Smad1 , Smad2 , Smad3 , Smad5 и Smad8/9 [3] и участвуют в прямой передаче сигналов от рецептора TGF-B. [4]
Smad4 - единственный известный человеческий Co-Smad, и он играет роль партнера R-Smads для набора корегуляторов в комплекс. [5]
Наконец, Smad6 и Smad7 — это I-Smad, которые подавляют активность R-Smad. [6] [7] Хотя Smad7 является общим ингибитором сигнала TGF-B, Smad6 более специфически связывается с передачей сигналов BMP. R/Co-Smads в основном расположены в цитоплазме, но после передачи сигналов TGF-β накапливаются в ядре, где они могут связываться с ДНК и регулировать транскрипцию. Однако I-Smads преимущественно обнаруживаются в ядре, где они могут действовать как прямые регуляторы транскрипции. [8]
До открытия Smads было неясно, какие нижестоящие эффекторы отвечают за передачу сигналов TGF-B. Smads были впервые обнаружены у дрозофилы , у которой они известны как матери против dpp (Mad), [примечание 1] посредством генетического скрининга доминантных энхансеров декапентаплегики ( dpp), версии TGF-B у дрозофилы . [10] Исследования показали, что нулевые мутанты Mad демонстрируют сходные фенотипы с мутантами dpp, что позволяет предположить, что Mad играет важную роль в некоторых аспектах сигнального пути dpp. [10]
Аналогичный скрининг, проведенный в белке SMA Caenorhabditis elegans (из гена sma , отвечающего за малый размер тела), выявил три гена, Sma-2, Sma-3 и Sma-4, которые имели мутантные фенотипы, аналогичные фенотипам TGF-B-подобного рецептора. Даф-4 . [11] Человеческий гомолог Mad и Sma был назван Smad1, сочетание ранее обнаруженных генов. Было обнаружено, что при инъекции в шляпки эмбрионов животных Xenopus Smad1 способен воспроизводить вентрализующие эффекты мезодермы, которые BMP4 , член семейства TGF-B, оказывает на эмбрионы. Кроме того, было продемонстрировано, что Smad1 обладает трансактивационной способностью, локализованной на карбокси-конце, которую можно усилить добавлением BMP4. Эти данные свидетельствуют о том, что Smad1 частично ответственен за передачу сигналов TGF-B. [12]
Smads имеют длину примерно от 400 до 500 аминокислот и состоят из двух глобулярных областей на амино- и карбокси-концах, соединенных линкерной областью. Эти глобулярные области высококонсервативны в R-Smads и Co-Smads и называются Mad гомологией 1 (MH1) на N-конце и MH2 на C-конце. Домен MH2 также консервативен в I-Smads. Домен MH1 в первую очередь участвует в связывании ДНК, тогда как MH2 отвечает за взаимодействие с другими Smads, а также за распознавание коактиваторов транскрипции и корепрессоров. [13] R-Smads и Smad4 взаимодействуют с несколькими мотивами ДНК через домен MH1. Эти мотивы включают CAGAC и его вариант CAGCC, а также консенсусную последовательность длиной 5 пар оснований GGC(GC)|(CG). [14] [15] Рецепторно-фосфорилированные R-Smads могут образовывать гомотримеры, а также гетеротримеры с Smad4 in vitro посредством взаимодействия между доменами MH2. Тримеры одной молекулы Smad4 и двух рецептор- фосфорилированных молекул R-Smad считаются преобладающими эффекторами регуляции транскрипции TGF-β. [13] Линкерная область между MH1 и MH2 является не просто соединителем, но также играет роль в функции и регуляции белка. В частности, R-Smad фосфорилируются в ядре в линкерном домене с помощью CDK8 и 9, и это фосфорилирование модулирует взаимодействие белков Smad с активаторами и репрессорами транскрипции. Более того, после этого этапа фосфорилирования линкер подвергается второму раунду фосфорилирования с помощью GSK3, маркируя Smads для их распознавания убиквитинлигазами и направляя их на опосредованную протеасомами деградацию. [16] Активаторы транскрипции и убиквитинлигазы содержат пары WW-доменов . [17] Эти домены взаимодействуют с мотивом PY, присутствующим в линкере R-Smad, а также с фосфорилированными остатками, расположенными вблизи мотива. Действительно, различные паттерны фосфорилирования, генерируемые CDK8/9 и GSK3, определяют специфические взаимодействия либо с активаторами транскрипции, либо с убиквитинлигазами. [18] [19] Примечательно, что линкерная область имеет самую высокую концентрацию аминокислотных различий среди многоклеточных животных, хотя сайты фосфорилирования и мотив PY высоко консервативны.
Компоненты пути TGF-бета и, в частности, R-Smads, Co-Smad и I-Smads, представлены в геноме всех многоклеточных животных, секвенированных на сегодняшний день. Уровень консервативности последовательностей белков Co-Smad и R-Smads у разных видов чрезвычайно высок. Такой уровень консервативности компонентов и последовательностей позволяет предположить, что общие функции пути TGF-бета с тех пор в целом остались неизменными. [20] [21] I-Smads имеют консервативные домены MH2, но расходятся по доменам MH1 по сравнению с R-Smads и Co-Smads. [22]
Лиганды TGF-B связывают рецепторы, состоящие из серин/треониновых киназ типа 1 и типа 2 , которые служат для внутриклеточного распространения сигнала. Связывание лиганда стабилизирует рецепторный комплекс, состоящий из двух рецепторов 1-го типа и двух рецепторов 2-го типа. [23] Рецепторы типа 2 затем могут фосфорилировать рецепторы типа 1 в местах домена GS, расположенных на N-конце киназного домена типа 1. [23] Это событие фосфорилирования активирует рецепторы типа 1, делая их способными к дальнейшему распространению сигнала TGF-B через Smads. Рецепторы типа 1 фосфорилируют R-Smads по двум С-концевым серинам, которые расположены в виде мотива SSXS. Smads локализуются на поверхности клетки с помощью белков якоря Smad для активации рецепторов (SARA), помещая их рядом с киназами рецепторов 1 типа для облегчения фосфорилирования. [24] Фосфорилирование R-Smad приводит к его диссоциации от SARA, обнажая последовательность ядерного импорта, а также способствуя его ассоциации с Co-Smad. Этот комплекс Smad затем локализуется в ядре, где он способен связывать гены-мишени с помощью других ассоциированных белков. [25]
I-Smads нарушают передачу сигналов TGF-B посредством различных механизмов, включая предотвращение ассоциации R-Smads с рецепторами типа 1 и Co-Smads, подавление рецепторов типа 1 и внесение транскрипционных изменений в ядро. Консервативный домен MH2 I-Smads способен связываться с рецепторами типа 1, что делает его конкурентным ингибитором связывания R-Smad. После активации R-Smad он образует гетеромерный комплекс с I-Smad, который предотвращает его ассоциацию с Co-Smad. Кроме того, I-Smad привлекает убиквитинлигазу для активации R-Smad для деградации, эффективно подавляя сигнал TGF-β. [8] I-Smads в ядре также конкурируют с комплексами R/Co-Smad за ассоциацию с ДНК-связывающими элементами. [26] Репортерные анализы показывают, что слияние I-Smads с ДНК-связывающей областью репортерных генов снижает их экспрессию, что позволяет предположить, что I-Smads действуют как репрессоры транскрипции. [27]
Во взрослых клетках TGF-β ингибирует развитие клеточного цикла, не позволяя клеткам совершать фазовый переход G1/S. [28] Это явление присутствует в эпителиальных клетках многих органов и частично регулируется сигнальным путем Smad. Точный механизм контроля немного различается в зависимости от типа клеток.
Одним из механизмов, с помощью которого Smads облегчает цитостаз, индуцированный TGF-B, является подавление Myc , который является фактором транскрипции, который способствует росту клеток. Myc также репрессирует p15(Ink4b) и p21(Cip1), которые являются ингибиторами Cdk4 и Cdk2 соответственно. [29] Когда TGF-β отсутствует, в цитоплазме существует репрессорный комплекс, состоящий из Smad3 и факторов транскрипции E2F4 и p107. Однако при наличии сигнала TGF-B этот комплекс локализуется в ядре, где он связывается с Smad4 и связывается с ингибирующим элементом TGF-B (TIE) промотора Myc, подавляя его транскрипцию. [30]
Помимо Myc, Smads также участвуют в подавлении белков-ингибиторов ДНК-связывания (ID). ID представляют собой факторы транскрипции, которые регулируют гены, участвующие в дифференцировке клеток, поддерживая мультипотентность стволовых клеток и способствуя непрерывному клеточному циклу. [31] Таким образом, подавление белков ID является путем, с помощью которого передача сигналов TGF-B может остановить клеточный цикл. При скрининге ДНК-микрочипов было обнаружено, что Id2 и Id3 репрессируются TGF-B, но индуцируются передачей сигналов BMP. Нокаут генов Id2 и Id3 в эпителиальных клетках усиливает ингибирование клеточного цикла TGF-B, показывая, что они важны в обеспечении этого цитостатического эффекта. [32] Smads являются как прямым, так и косвенным ингибитором экспрессии Id. Сигнал TGF-B запускает фосфорилирование Smad3, которое, в свою очередь, активирует ATF3, фактор транскрипции, который индуцируется во время клеточного стресса. Затем Smad3 и ATF3 координируются, подавляя транскрипцию Id1, что приводит к ее подавлению. [33] Косвенно, снижение Id является вторичным эффектом репрессии Myc с помощью Smad3. Поскольку Myc является индуктором Id2, подавление Myc также приведет к снижению передачи сигналов Id2, что способствует остановке клеточного цикла. [31]
Исследования показывают, что Smad3, но не Smad2, является важным эффектором цитостатических эффектов TGF-B. Истощение эндогенного Smad3 посредством РНК-интерференции было достаточным, чтобы повлиять на цитостаз TGF-B. Однако истощение Smad2 аналогичным образом усиливало, а не останавливало остановку клеточного цикла, индуцированную TGF-B. Это предполагает, что, хотя Smad3 необходим для цитостатического эффекта TGF-B, соотношение Smad3 и Smad2 модулирует интенсивность ответа. Однако сверхэкспрессия Smad2 для изменения этого соотношения не влияла на цитостатический ответ. Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы определенно доказать, что соотношение Smad3 и Smad2 регулирует интенсивность цитостатического эффекта в ответ на TGF-B. [34]
Также было обнаружено, что белки Smad являются прямыми регуляторами транскрипции Cdk4. Репортерные анализы, в которых люцифераза была помещена под промотор Cdk4, показали повышенную экспрессию люциферазы, когда Smad4 был нацелен на миРНК . Репрессия Smad2 и 3 не имела какого-либо существенного эффекта, что позволяет предположить, что Cdk4 напрямую регулируется Smad4. [35]
Дефекты передачи сигналов Smad могут привести к резистентности к TGF-B, вызывая нарушение регуляции роста клеток. Нарушение регуляции передачи сигналов TGF-B связано со многими типами рака, включая рак поджелудочной железы, толстой кишки, молочной железы, легких и простаты. [36] Smad4 чаще всего мутирует при раке человека, особенно при раке поджелудочной железы и толстой кишки. Smad4 инактивируется почти в половине случаев рака поджелудочной железы. В результате после его открытия Smad4 впервые был назван удаленным в локусе 4 рака поджелудочной железы (DPC4). [37] Мутации Smad4 зародышевой линии частично ответственны за генетическую предрасположенность к семейному ювенильному полипозу человека , что подвергает человека высокому риску развития потенциально раковых желудочно-кишечных полипов . Экспериментальные доказательства, подтверждающие это наблюдение, получены в исследовании, показывающем, что у гетерозиготных мышей с нокаутом Smad4 (+/-) к 100 неделям равномерно развивались желудочно-кишечные полипы. [38] Многие семейные мутанты Smad4 встречаются в домене MH2, что нарушает способность белка образовывать гомо- или гетероолигомеры , тем самым нарушая передачу сигнала TGF-B. [39]
Несмотря на данные, показывающие, что Smad3 более важен, чем Smad2, в передаче сигналов TGF-B, частота мутаций Smad3 при раке ниже, чем у Smad2. [40] [41] Опухолевые клетки хориокарциномы устойчивы к передаче сигналов TGF-B, а также лишены экспрессии Smad3. Исследования показывают, что повторного введения Smad3 в клетки хориокарциномы достаточно для повышения уровня TIMP-1 (тканевого ингибитора металлопротеазы-1), медиатора антиинвазивного эффекта TGF-B, и, таким образом, восстановления передачи сигналов TGF-B. Однако повторного введения Smad3 было недостаточно для восстановления антиинвазивного эффекта TGF-B. Это указывает на то, что другие сигнальные механизмы, помимо Smad3, дефектны при хориокарциноме, резистентной к TGF-B. [37]
У пациентов с болезнью Альцгеймера наблюдаются повышенные уровни TGF-B и фосфорилированного Smad2 в нейронах гиппокампа . [42] Это открытие кажется парадоксальным, поскольку ранее было показано, что TGF-B оказывает нейропротекторное действие на пациентов с болезнью Альцгеймера. Это предполагает, что какой-то аспект передачи сигналов TGF-B является дефектным, в результате чего TGF-B теряет свои нейропротекторные эффекты. Исследования показали, что фосфорилированный Smad2 эктопически локализуется в цитоплазматических гранулах, а не в ядре, в нейронах гиппокампа пациентов с болезнью Альцгеймера. В частности, эктопически расположенные фосфорилированные Smad2 были обнаружены внутри амилоидных бляшек и прикреплены к нейрофибриллярным клубкам . Эти данные позволяют предположить, что Smad2 участвует в развитии болезни Альцгеймера. [43] Недавние исследования показывают, что пептидил-пролил-цис-транс-изомераза, взаимодействующая с NIMA 1 (PIN1), участвует в стимулировании аномальной локализации Smad2. Было обнаружено, что Pin1 совместно локализуется с Smad2/3 и фосфорилированными тау-белками внутри цитоплазматических гранул, что указывает на возможное взаимодействие. Трансфекция клеток, экспрессирующих Smad2, с помощью Pin1 вызывает опосредованную протеасомами деградацию Smad2, а также повышенную ассоциацию Smad2 с фосфорилированным тау. Эта петля обратной связи является двунаправленной; Smad2 также способен увеличивать синтез мРНК Pin1. Таким образом, два белка могут попасть в «порочный круг» регуляции. Pin1 вызывает связывание себя и Smad2 в нерастворимые нейрофибриллярные клубки, что приводит к низким уровням обоих растворимых белков. Затем Smad2 стимулирует синтез РНК Pin1, чтобы попытаться компенсировать это, что только приводит к еще большей деградации Smad2 и ассоциации с нейрофибриллярными клубками. [44]
Нарушение регуляции передачи сигналов TGF-B/Smad является возможным патогенным механизмом хронического заболевания почек . В почках TGF-B1 способствует накоплению внеклеточного матрикса (ECM), увеличивая его выработку и ингибируя его деградацию, что характерно для почечного фиброза . [45] Сигнал TGF-B1 передается R-Smads Smad2 и Smad3, оба из которых, как обнаружено, сверхэкспрессируются в больных почках. [46] У мышей с нокаутом Smad3 наблюдается замедление прогрессирования фиброза почек, что указывает на его важность в регуляции заболевания. [47] И наоборот, ингибирование Smad2 в клетках почек (полный нокаут Smad2 является летальным для эмбриона) на самом деле приводит к более тяжелому фиброзу, что позволяет предположить, что Smad2 действует антагонистически по отношению к Smad3 при прогрессировании почечного фиброза. [48] В отличие от R-Smads, белок Smad7 обычно недостаточно экспрессируется в больных клетках почек. Эта потеря ингибирования TGF-B приводит к увеличению количества активного Smad2/3, что способствует прогрессированию фиброза почек, как описано выше. [49]