Фактор селективности — это количественная мера того, насколько эффективен антибиотик в процессе отбора генов. [1] Он измеряет способность антибиотика выбирать трансфицированные (устойчивые) клетки, содержащие селективный маркер, при этом убивая нетрансфицированные (чувствительные) клетки, не содержащие селективный маркер . Фактор селективности выше 10 является оптимальным. Это означает, что концентрация антибиотика достаточна для уничтожения нетрансфицированных клеток, но недостаточно токсична для уничтожения трансфицированных клеток. Фактор селективности ниже 10 означает, что концентрация антибиотика, необходимая для отбора, слишком близка к токсичной концентрации для трансфицированных клеток. В результате выживает меньше трансфицированных клеток и больше нетрансфицированных клеток. В этом случае следует рассмотреть альтернативный антибиотик.
Метод использует модифицированный анализ МТТ . Анализ МТТ представляет собой колориметрический анализ, используемый для оценки метаболической активности клеток. Анализ основан на восстановлении желтой соли тетразолия (МТТ) активными клетками для получения фиолетовых кристаллов формазана, которые накапливаются в живых клетках. [2] Клетки лизируются, кристаллы растворяются, а поглощение раствора анализируется на спектрофотометре как мера жизнеспособности клеток. В ситуациях, когда использование МТТ проблематично, можно рассмотреть скрининг PI или Sytox Green в флуоресцентном планшетном ридере. [3] Следующим шагом является создание кривой уничтожения, которая определяет идеальную концентрацию селективного антибиотика для уничтожения нетрансфицированных клеток (рис. 1А). Кривые создаются как для чувствительных клеток, так и для резистентных клеток. Можно рассчитать полумаксимальную ингибирующую концентрацию ( IC50 ), которая измеряет эффективность антибиотика.
Коэффициент селективности рассчитывается следующим образом:
SF = IC 5 0R/IC 50 S, где SF = фактор селективности; IC 50 = полумаксимальная ингибирующая концентрация; R = резистентные клетки; S = чувствительные клетки
Фактор селективности имеет следующие преимущества: он является количественным, поэтому его можно оценить в числовом виде с помощью микропланшетного ридера, он упрощает процесс создания стабильных линий клеток (анализ можно завершить за 3 дня), он учитывает как чувствительные, так и резистентные клетки, а также позволяет сравнивать постоянство и качество антибиотиков из разных партий, поставщиков и методов производства. [ необходима ссылка ]
Фактор селективности может быть использован для создания стабильно трансфицированных клеточных линий, важного инструмента в разработке лекарств, биомедицинских исследованиях и исследовании биологических путей. Создание клеточной линии включает трансфекцию (перенос гена в клеточную линию) и селекцию (применение селективного давления в форме антибиотика. [4] Эффективность трансфекции зависит от типа клеток, плотности клеток, вектора и метода трансфекции. Эффективность селекции зависит от способности антибиотика убивать родительские клетки, но не трансфицированные клетки. [ необходима цитата ]