Синтетические биологические схемы — это приложение синтетической биологии , где биологические части внутри клетки предназначены для выполнения логических функций, имитирующих функции, наблюдаемые в электронных схемах . Обычно эти схемы классифицируются как генетические схемы , схемы РНК или белковые схемы , в зависимости от типов биомолекул , которые взаимодействуют для создания поведения схемы. Приложения всех трех типов схем варьируются от простого индуцирования производства до добавления измеримого элемента, такого как зеленый флуоресцентный белок , к существующей естественной биологической схеме , до внедрения совершенно новых систем из многих частей. [1]
Цель синтетической биологии — создать массив настраиваемых и характеризуемых частей или модулей, с помощью которых можно легко спроектировать и реализовать любую желаемую синтетическую биологическую схему. [2] Эти схемы могут служить методом модификации клеточных функций, создания клеточных реакций на условия окружающей среды или влияния на клеточное развитие. Внедряя рациональные, контролируемые логические элементы в клеточные системы, исследователи могут использовать живые системы как сконструированные « биологические машины » для выполнения широкого спектра полезных функций. [1]
Первой детально изученной естественной генной схемой был lac-оперон . В исследованиях диауктического роста E. coli на двухсахарных средах Жак Моно и Франсуа Жакоб обнаружили, что E. coli преимущественно потребляет более легко перерабатываемую глюкозу , прежде чем переключиться на метаболизм лактозы . Они обнаружили, что механизм, который контролировал функцию метаболического «переключения», был двухкомпонентным механизмом управления на lac-опероне. Когда в клетке присутствует лактоза, вырабатывается фермент β-галактозидаза для превращения лактозы в глюкозу или галактозу . Когда лактоза отсутствует в клетке, lac-репрессор ингибирует выработку фермента β-галактозидазы, чтобы предотвратить любые неэффективные процессы внутри клетки.
Оперон lac используется в биотехнологической промышленности для производства рекомбинантных белков для терапевтического использования. Ген или гены для производства экзогенного белка помещаются в плазмиду под контролем промотора lac. Первоначально клетки выращиваются в среде, не содержащей лактозу или другие сахара, поэтому новые гены не экспрессируются. Как только клетки достигают определенной точки своего роста, добавляется изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) . IPTG, молекула, похожая на лактозу, но с серной связью, которая не гидролизуется, так что E. coli не переваривает ее, используется для активации или « индукции » производства нового белка. После того, как клетки индуцированы, IPTG трудно удалить из клеток, и поэтому трудно остановить экспрессию.
Два ранних примера синтетических биологических цепей были опубликованы в журнале Nature в 2000 году. Один из них, созданный Тимом Гарднером, Чарльзом Кантором и Джимом Коллинзом , работающими в Бостонском университете , продемонстрировал «бистабильный» переключатель в E. coli . Переключатель включается при нагревании культуры бактерий и выключается при добавлении IPTG. Они использовали зеленый флуоресцентный белок в качестве репортера для своей системы. [3] Второй пример, созданный Майклом Эловицем и Станисласом Лейблером , показал, что три гена-репрессора могут быть соединены для формирования отрицательной обратной связи, называемой Repressilator , которая производит самоподдерживающиеся колебания уровней белка в E. coli. [4]
В настоящее время синтетические схемы являются бурно развивающейся областью исследований в области системной биологии , и каждый год публикуется все больше публикаций, подробно описывающих синтетические биологические схемы. [5] Также наблюдается значительный интерес к поощрению образования и просветительской деятельности: Международный конкурс генетически модифицированных машин [6] управляет созданием и стандартизацией деталей BioBrick как средства, позволяющего студентам и старшеклассникам разрабатывать собственные синтетические биологические схемы.
Существуют как непосредственные, так и долгосрочные приложения для использования синтетических биологических цепей, включая различные приложения для метаболической инженерии и синтетической биологии . Успешно продемонстрированные включают фармацевтическое производство, [7] и производство топлива. [8] Однако методы, включающие прямое генетическое введение, по своей сути неэффективны без привлечения основных принципов синтетических клеточных цепей. Например, каждая из этих успешных систем использует метод введения индукции или экспрессии «все или ничего». Это биологическая цепь, в которую вводится простой репрессор или промотор для облегчения создания продукта или ингибирования конкурирующего пути. Однако из-за ограниченного понимания клеточных сетей и естественных цепей реализация более надежных схем с более точным контролем и обратной связью затруднена. В этом заключается непосредственный интерес к синтетическим клеточным цепям.
Развитие понимания клеточных схем может привести к новым захватывающим модификациям, таким как клетки, которые могут реагировать на стимулы окружающей среды. Например, можно разработать клетки, которые сигнализируют о токсичном окружении и реагируют, активируя пути, используемые для деградации воспринимаемого токсина. [9] Чтобы разработать такую клетку, необходимо создать сложную синтетическую клеточную схему, которая может соответствующим образом реагировать на заданный стимул.
Учитывая, что синтетические клеточные схемы представляют собой форму контроля клеточной активности, можно предположить, что при полном понимании клеточных путей можно спроектировать клетки «plug and play» [1] с четко определенными генетическими схемами. Широко распространено мнение, что если сгенерировать надлежащий набор инструментов из частей, [10] можно разработать синтетические клетки, реализующие только пути, необходимые для выживания и воспроизводства клеток. Из этой клетки, которую следует рассматривать как минимальную геномную клетку, можно добавлять части из набора инструментов, чтобы создать четко определенный путь с соответствующей синтетической схемой для эффективной системы обратной связи. Благодаря базовому методу построения с нуля и предлагаемой базе данных отображенных частей схем, методы, отражающие те, которые используются для моделирования компьютерных или электронных схем, могут использоваться для перепроектирования клеток и моделирования клеток для легкого устранения неполадок и прогнозируемого поведения и выходов.
Эловиц и др., а также Фунг и др. создали колебательные контуры, которые используют множественные саморегулирующиеся механизмы для создания зависящих от времени колебаний экспрессии генного продукта. [11] [12]
Гарднер и др. использовали взаимное подавление между двумя блоками управления для создания реализации тумблера, способного управлять клетками бистабильным образом: кратковременные стимулы приводят к устойчивым реакциям. [3]
Регуляция генов является неотъемлемой частью процессов развития. Во время развития гены включаются и выключаются в разных тканях, изменения в регуляторных механизмах могут привести к генетическому переключению в бистабильной системе, генные переключатели служат сайтами связывания регуляторных молекул. Это белки, которые активируют транскрипцию, когда они попадают на генный переключатель, и тем самым экспрессируют ген, который, как ожидалось, будет работать как запоминающее устройство, позволяя выбирать и поддерживать решения о судьбе клетки. [13]
Переключатель, который работает с использованием двух взаимно ингибирующих генов, каждый промотор ингибируется репрессором, который транскрибируется противоположным промотором. Конструкция переключателя: Индуктор 1 инактивирует репрессор 1, что означает, что вырабатывается репрессор 2. Репрессор 2, в свою очередь, останавливает транскрипцию гена репрессора 1 и гена-репортера. [14]
Используя отрицательную обратную связь и идентичные промоторы, линеаризованные генные цепи могут навязывать однородную экспрессию генов, которая линейно зависит от концентрации внеклеточного химического индуктора. [17]
Синтетические генные цепи могут контролировать гетерогенность экспрессии генов, которую можно контролировать независимо от среднего значения экспрессии генов. [18]
Инженерные системы являются результатом внедрения комбинаций различных механизмов управления. Ограниченный механизм подсчета был реализован с помощью каскада генов, контролируемых импульсами [19] , а применение логических элементов позволяет осуществлять генетическое «программирование» клеток, как в исследовании Табора и др., которые синтезировали светочувствительную бактериальную программу обнаружения краев. [20]
Недавние разработки в области искусственного синтеза генов и соответствующее увеличение конкуренции в отрасли привели к значительному снижению цены и времени ожидания синтеза генов и помогли улучшить методы, используемые в проектировании схем. [21] В настоящее время проектирование схем улучшается медленными темпами из-за недостаточной организации известных множественных взаимодействий генов и математических моделей. Эта проблема решается путем применения программного обеспечения для автоматизированного проектирования (САПР) для предоставления мультимедийных представлений схем с помощью изображений, текста и языка программирования, применяемого к биологическим схемам. [22] Некоторые из наиболее известных программ САПР включают GenoCAD, фреймворк Clotho и j5. [23] [24] [25] GenoCAD использует грамматики, которые являются либо открытым исходным кодом, либо сгенерированными пользователем «правилами», которые включают доступные гены и известные взаимодействия генов для клонирования организмов. Фреймворк Clotho использует стандартные правила Biobrick. [22]