FlAsH-EDT 2 — это мышьякорганическое соединение с молекулярной формулой C 24 H 18 As 2 O 5 S 4 . Его структура основана на ядре флуоресцеина с двумя 1,3,2-дитиарсолановыми заместителями . Он используется в биоаналитических исследованиях в качестве флуоресцентной метки для визуализации белков в живых клетках. [1] FlAsH-EDT 2 — это аббревиатура от флуоресцинового мышьяковистого связующего вещества для волос — этандитиола , и представляет собой бледно - желтое или розоватое флуорогенное твердое вещество. Он имеет полуструктурную формулу (C 2 H 4 AsS 2 ) 2 - (C 13 H 5 O 3 )-C 6 H 4 COOH , представляющую дитиарсолановые заместители, связанные с ядром гидроксиксантона , присоединенным к о -замещенной молекуле бензойной кислоты .
FlAsH-EDT 2 используется для сайт-специфической маркировки, селективно связываясь с белками, содержащими мотив тетрацистеина ( TC) Cys-Cys-Xxx-Xxx-Cys-Cys, и становясь флуоресцентным при связывании. Он демонстрирует неспецифическое связывание с эндогенными белками, богатыми цистеином, то есть он связывается с сайтами, отличными от интересующего (CCXXCC). Дальнейшая оптимизация мотива TC выявила улучшенную аффинность связывания FlAsH с мотивом CCPGCC [2] и более высокий квантовый выход , когда мотив тетрацистеина фланкирован специфическими остатками (HRWCCPGCCKTF или FLNCCPGCCMEP). [3]
FlAsH-EDT 2 можно приготовить из флуоресцеина в три этапа (см. рисунок). [1]
Многие исследования показывают, что трехвалентные соединения мышьяка связываются с парами остатков цистеина. Это связывание отвечает за токсичность многих соединений мышьяка. [4] Связывание обращается 1,2-этандитиолом, который прочно связывается с соединениями мышьяка, как показано стабильностью FlAsH-EDT 2 . [5] Такая сильная связь сера-мышьяк может, опять же, регулироваться путем разработки пептидного домена, который проявляет более высокое сродство к мышьяку, например, мотива тетрацистеина. Модулируя расстояние между двумя парами остатков цистеина и пространство между центрами мышьяка FlAsH-EDT 2 , можно достичь кооперативной и энтропийно благоприятной связи дитиол-мышьяк. [6]
Таким образом, связывание FlAsH-EDT 2 подлежит равновесию. Образование аддукта FlAsH-пептида может быть благоприятным при низкой концентрации EDT (ниже 10 мкМ ) и обратимым при высокой концентрации EDT (выше 1 мМ). [6]
FlAsH становится флуоресцентным при связывании мотива тетрацистеина. Он возбуждается при 508 нм и испускает 528 нм, зелено-желтый, свободного флуоресцеина. Квантовый выход составляет 0,49 для 250 нМ FlAsH, связанного с модельным тетрацистеинсодержащим пептидом в фосфатно-солевом буфере при pH 7,4. [6]
В целом, FlAsH-EDT 2 имеет 0,1-0,6 флуоресцентной квантовой эффективности с несколькими пределами обнаружения мкМ для диффузной цитозольной метки и 30-80 коэффициентов экстинкции L ммоль −1 см −1 . Комплекс FlAsH-пептид также продемонстрировал перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET) от флуоресцентных белков, таких как усиленный циановый флуоресцентный белок (ECFP) зеленого флуоресцентного белка (GFP). [7]
FlAsH-EDT 2 обеспечивает менее токсичную и более специфичную флуоресцентную маркировку, которая проницаема для мембраны. [8] Модификация флуоресцеиновой части также позволяет проводить многоцветный анализ. [9] Было доказано, что это хорошая альтернатива зеленым флуоресцентным белкам (GFP) с тем преимуществом, что FlAsH-EDT 2 намного меньше ( молярная масса < 1 кДа ) по сравнению с GFP (~30 кДа), поэтому сводит к минимуму возмущение активности исследуемого белка. [1] [10]
В прошлом FlAsH-EDT 2 широко использовался для изучения ряда клеточных событий in vivo и субклеточных структур в клетках животных, белка матрицы вируса Эбола и неправильного сворачивания белков. С помощью электронной микроскопии FlAsH-EDT 2 также используется для изучения процессов перемещения белков in situ . [11] Совсем недавно он использовался в расширенном исследовании растительных клеток, таких как Arabidopsis и табак. [12]