stringtranslate.com

Taq-полимераза

Taq -полимераза — это термостабильная ДНК-полимераза , названная в честь термофильного эубактериального микроорганизма Thermus aquaticus , из которого она была первоначально выделена китайской женщиной-ученым Элис Чиен и др. в 1976 году. [1] Ее название часто сокращается до Taq или Taq pol . Она часто используется в полимеразной цепной реакции (ПЦР), методе значительного увеличения количества коротких сегментов ДНК .

T. aquaticus — это бактерия , которая обитает в горячих источниках и гидротермальных источниках , а полимераза Taq была идентифицирована [1] как фермент, способный выдерживать условия денатурации белка (высокую температуру), необходимые во время ПЦР. [2] Поэтому она заменила ДНК-полимеразу из E. coli, первоначально использовавшуюся в ПЦР. [3]

Ферментативные свойства

Оптимальная температура для активности Taq составляет 75–80 °C, с периодом полураспада более 2 часов при 92,5 °C, 40 минут при 95 °C и 9 минут при 97,5 °C, и может реплицировать цепочку ДНК из 1000 пар оснований менее чем за 10 секунд при 72 °C. [4] При 75–80 °C Taq достигает своей оптимальной скорости полимеризации около 150 нуклеотидов в секунду на молекулу фермента, и любые отклонения от оптимального температурного диапазона подавляют скорость расширения фермента. Один Taq синтезирует около 60 нуклеотидов в секунду при 70 °C, 24 нуклеотида/сек при 55 °C, 1,5 нуклеотида/сек при 37 °C и 0,25 нуклеотида/сек при 22 °C. При температуре выше 90 °C Taq проявляет очень малую активность или вообще не проявляет ее, но сам фермент не денатурирует и остается нетронутым. [5] Присутствие определенных ионов в реакционном сосуде также влияет на удельную активность фермента. Небольшие количества хлорида калия (KCl) и иона магния (Mg 2+ ) способствуют ферментативной активности Taq. Taq - полимераза максимально активируется при 50 мМ KCl, в то время как оптимальная концентрация Mg 2+ определяется концентрацией нуклеозидтрифосфатов (dNTP). Высокие концентрации KCl и Mg 2+ ингибируют активность Taq . [6] Обычный хелатор ионов металлов EDTA напрямую связывается с Taq в отсутствие этих ионов металлов. [7]

Одним из недостатков Taq является отсутствие у него 3'- 5 ' экзонуклеазной корректирующей активности [4], что приводит к относительно низкой точности репликации. Первоначально его частота ошибок составляла около 1 на 9000 нуклеотидов. [8] Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архей, такие как Pfu ДНК-полимераза , обладающая корректирующей активностью, и используются вместо (или в сочетании с) Taq для высокоточной амплификации. [9] Точность может сильно различаться между Taq, что имеет серьезные последствия для приложений секвенирования ниже по течению. [10]

Taq производит ДНК-продукты, которые имеют выступы A ( аденин ) на своих 3'-концах. Это может быть полезно при клонировании TA , при котором используется клонирующий вектор (например, плазмида ), имеющий выступ T ( тимин ) 3', который дополняет выступ A продукта ПЦР, тем самым позволяя лигировать продукт ПЦР в плазмидный вектор.

В ПЦР

В начале 1980-х годов Кэри Маллис работал в Cetus Corporation над применением синтетических ДНК в биотехнологии . Он был знаком с использованием олигонуклеотидов ДНК в качестве зондов для связывания с цепями целевой ДНК, а также с их использованием в качестве праймеров для секвенирования ДНК и синтеза кДНК . В 1983 году он начал использовать два праймера, один для гибридизации с каждой цепью целевой ДНК, и добавлять ДНК-полимеразу в реакцию. Это привело к экспоненциальной репликации ДНК , [11] значительно усиливая дискретные сегменты ДНК между праймерами. [3]

Однако после каждого раунда репликации смесь необходимо нагреть выше 90 °C для денатурации новообразованной ДНК, что позволяет цепям разделиться и действовать как шаблоны в следующем раунде амплификации. Этот этап нагревания также инактивирует ДНК-полимеразу, которая использовалась до открытия полимеразы Taq , фрагмент Кленова (полученный из E. coli ). Полимераза Taq хорошо подходит для этого применения, поскольку она способна выдерживать температуру 95 °C, которая необходима для разделения цепей ДНК без денатурации.

Использование термостабильного Taq позволяет проводить ПЦР при высокой температуре (~60 °C и выше), что обеспечивает высокую специфичность праймеров и снижает образование неспецифических продуктов, таких как димер праймера . Кроме того, использование термостабильной полимеразы устраняет необходимость добавления нового фермента в каждый раунд термоциклирования. Для выполнения всего процесса можно использовать одну закрытую пробирку в относительно простой машине . Таким образом, использование полимеразы Taq стало ключевой идеей, которая сделала ПЦР применимой к широкому спектру задач молекулярной биологии, касающихся анализа ДНК. [2]

Патентные вопросы

В конечном итоге Hoffmann-La Roche выкупила патенты на ПЦР и Taq у Cetus за 330 миллионов долларов, из которых она могла получить до 2 миллиардов долларов в виде роялти. [12] В 1989 году журнал Science Magazine назвал полимеразу Taq своей первой « Молекулой года ». Кэри Маллис получила Нобелевскую премию по химии в 1993 году, единственную, присужденную за исследования, проведенные в биотехнологической компании. К началу 1990-х годов метод ПЦР с полимеразой Taq использовался во многих областях, включая фундаментальные исследования молекулярной биологии, клинические испытания и судебную экспертизу . Он также начал находить неотложное применение в прямом обнаружении ВИЧ при СПИДе . [ 13]

В декабре 1999 года окружной судья США Вон Уокер постановил, что патент 1990 года, касающийся полимеразы Taq , был выдан, отчасти, на основе вводящей в заблуждение информации и ложных заявлений ученых из Cetus Corporation . Постановление поддержало иск Promega Corporation против Hoffman-La Roche , которая приобрела патенты Taq в 1991 году. Судья Уокер сослался на предыдущие открытия других лабораторий, включая лабораторию профессора Джона Трелы на кафедре биологических наук Университета Цинциннати , в качестве основания для постановления. [14]

Структура домена

Taq Pol A имеет общую структуру, похожую на структуру E. coli PolA. Средний 3'–5' экзонуклеазный домен, отвечающий за корректуру, был радикально изменен и не является функциональным. [15] Он имеет функциональный 5'-3' экзонуклеазный домен на аминоконце, описанный ниже. Остальные два домена действуют согласованно, посредством связанного движения доменов. [16]

Экзонуклеазный домен

Экзонуклеаза полимеразы Taq — это домен, обнаруженный в аминоконцеДНК- полимеразы Taq I (термостабильная). Он предполагает наличие мотива , похожего на рибонуклеазу H.Домен придаетполимеразе 5'- 3' экзонуклеазную активность. [17]

В отличие от того же домена в E. coli , который разрушает праймеры и должен быть удален путем переваривания для использования в ПЦР, [9] этот домен не считается разрушающим праймер. [18] Эта активность используется в зонде TaqMan : по мере формирования дочерних цепей зонды, комплементарные шаблону, вступают в контакт с полимеразой и расщепляются на флуоресцентные фрагменты. [19]

Связывание с ДНК

Taq -полимераза связана в своей активной зоне полимеразы с тупым концом дуплексной ДНК. Когда Taq -полимераза контактирует со связанной ДНК, ее боковые цепи образуют водородные связи с пуринами и пиримидинами ДНК. Та же область Taq -полимеразы, которая связана с ДНК, также связывается с экзонуклеазой. Эти структуры, связанные с Taq -полимеразой, имеют различные взаимодействия.

Мутанты

Сообщалось об эксперименте по направленному мутагенезу , который улучшает активность рудиментарной 3'-5' экзонуклеазы в 2 раза, но никогда не сообщалось, снижает ли это частоту ошибок. [20] Следуя аналогичному ходу мыслей, химерные белки были созданы путем отбора доменов из E. coli , Taq и полимеразы I T. neapolitana . Замена рудиментарного домена на функциональный из E. coli привела к получению белка с возможностью корректуры, но с более низкой оптимальной температурой и низкой термостабильностью. [21]

Были получены версии полимеразы без домена экзонуклеазы 5'-3', среди которых наиболее известны Klentaq или фрагмент Стоффеля . Полное отсутствие экзонуклеазной активности делает эти варианты подходящими для праймеров, которые демонстрируют вторичную структуру, а также для копирования кольцевых молекул. [9] Другие вариации включают использование Klentaq с высокоточной полимеразой, термосеквеназой , которая распознает субстраты, как это делает ДНК-полимераза T7 , мутанты с более высокой толерантностью к ингибиторам или версии с «доменной меткой», которые имеют дополнительный мотив спираль-шпилька-спираль вокруг каталитического сайта, чтобы удерживать ДНК более плотно, несмотря на неблагоприятные условия. [22]

Taq -полимераза

Значение в выявлении заболеваний

Благодаря улучшениям, которые Taq -полимераза обеспечила в ПЦР-репликации ДНК: более высокая специфичность, меньше неспецифических продуктов и более простые процессы и оборудование, она сыграла важную роль в усилиях по выявлению заболеваний. «Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний привело к возможности ранней диагностики и надлежащего лечения заболеваний, вызванных привередливыми патогенами, определения восприимчивости к антимикробным препаратам медленно растущих организмов и установления количества инфекции». [23] Внедрение Taq -полимеразы спасло бесчисленное количество жизней. Она сыграла важную роль в выявлении многих из самых страшных заболеваний в мире, включая: туберкулез, стрептококковый фарингит, атипичную пневмонию, СПИД, корь, гепатит и язвенные урогенитальные инфекции. ПЦР, метод, используемый для воссоздания копий определенных образцов ДНК, делает возможным обнаружение заболеваний путем нацеливания на определенную последовательность ДНК целевого патогена из образца пациента и амплификации следовых количеств показательных последовательностей путем копирования их до миллиардов раз. Хотя это наиболее точный метод обнаружения заболеваний, особенно ВИЧ, он не применяется так часто, как альтернативные, худшие тесты из-за относительно высокой стоимости, требуемой рабочей силы и времени. [24]

Зависимость от полимеразы Taq как катализатора процесса репликации ПЦР была подчеркнута во время пандемии COVID-19 2020 года. Нехватка необходимого фермента нарушила способность стран по всему миру производить тест-наборы для вируса. Без полимеразы Taq процесс обнаружения заболевания намного медленнее и утомительнее. [25]

Несмотря на преимущества использования полимеразы Taq в ПЦР-диагностике заболеваний, фермент не лишен недостатков. Ретровирусные заболевания (ВИЧ, HTLV-1 и HTLV-II) часто включают мутации с гуанина на аденин в своем геноме. Такие мутации позволяют ПЦР-тестам обнаруживать заболевания, но относительно низкая точность полимеразы Taq приводит к тому, что та же мутация G-на-A происходит, что может привести к ложноположительному результату теста. [26]

Смотрите также

На Викискладе есть медиафайлы по теме Taq-полимераза .

Ссылки

  1. ^ ab Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты из экстремального термофила Thermus aquaticus». Журнал бактериологии . 127 (3): 1550–7. doi : 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. PMC  232952. PMID  8432.
  2. ^ ab Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Science . 239 (4839): 487–91. Bibcode :1988Sci...239..487S. doi :10.1126/science.2448875. PMID  2448875.
  3. ^ ab Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (декабрь 1985 г.). "Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии". Science . 230 (4732): 1350–4. Bibcode :1985Sci...230.1350S. doi :10.1126/science.2999980. PMID  2999980. Архивировано из оригинала 2008-12-19.
  4. ^ ab Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (май 1993 г.). «Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы, лишенной экзонуклеазной активности от 5' до 3'». Методы и применение ПЦР . 2 (4): 275–87. doi : 10.1101/gr.2.4.275 . PMID  8324500.
  5. ^ Протоколы ПЦР: руководство по методам и приложениям . Иннис, Майкл А. Сан-Диего: Academic Press. 1990. ISBN 978-0123721808. OCLC  19723112.{{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )
  6. ^ Технология ПЦР: принципы и применение для амплификации ДНК . Эрлих, Генри А., 1943-. Нью-Йорк: Stockton Press. 1989. ISBN 978-0333489482. OCLC  19323242.{{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )
  7. ^ Лопата А, Жоярт Б, Сурани ЭВ, Такач Э, Безур Л, Левелес I и др. (октябрь 2019 г.). «Помимо хелатирования: ЭДТА прочно связывает ДНК-полимеразу Taq, MutT и dUTPase и напрямую ингибирует активность dNTPase». Биомолекулы . 9 (10): 621. дои : 10.3390/biom9100621 . ПМК 6843921 . ПМИД  31627475. 
  8. ^ Tindall KR, Kunkel TA (август 1988). «Точность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Thermus aquaticus». Биохимия . 27 (16): 6008–13. doi :10.1021/bi00416a027. PMID  2847780.
  9. ^ abc ван Пелт-Веркуил Э, ван Белкум А, Хейс Дж. П. (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . стр. 103–18. дои : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7. ISBN 978-1-4020-6240-7.
  10. ^ Brandariz-Fontes C, Camacho-Sanchez M, Vilà C, Vega-Pla JL, Rico C, Leonard JA (январь 2015 г.). «Влияние фермента и условий ПЦР на качество результатов высокопроизводительного секвенирования ДНК». Scientific Reports . 5 : 8056. Bibcode :2015NatSR...5E8056B. doi :10.1038/srep08056. PMC 4306961 . PMID  25623996. 
  11. ^ Маллис КБ (апрель 1990 г.). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Scientific American . 262 (4): 56–61, 64–5. Bibcode : 1990SciAm.262d..56M. doi : 10.1038/scientificamerican0490-56. PMID  2315679.
  12. ^ Fore J, Wiechers IR, Cook-Deegan R (июль 2006 г.). «Влияние деловой практики, лицензирования и интеллектуальной собственности на разработку и распространение полимеразной цепной реакции: исследование случая». Журнал биомедицинских открытий и сотрудничества . 1 : 7. doi : 10.1186/1747-5333-1-7 . PMC 1523369. PMID  16817955 . 
    Подробная история корпорации Cetus и коммерческих аспектов ПЦР.
  13. ^ Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (апрель 1989 г.). «Амплификация нуклеиновых кислот in vitro: обнаружение последовательностей с низким числом копий и применение для диагностики инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1». Clinical Microbiology Reviews . 2 (2): 217–26. doi :10.1128/CMR.2.2.217. PMC 358112 . PMID  2650862. 
  14. ↑ Курран, Крис, Bio-Medicine, 7 декабря 1999 г.
  15. ^ Eom SH, Wang J, Steitz TA (июль 1996). «Структура полимеразы Taq с ДНК в активном центре полимеразы». Nature . 382 (6588): 278–81. Bibcode :1996Natur.382..278E. doi :10.1038/382278a0. PMID  8717047. S2CID  4372845.
  16. ^ Bu Z, Biehl R, Monkenbusch M, Richter D, Callaway DJ (декабрь 2005 г.). «Связанное движение домена белка в полимеразе Taq, выявленное с помощью нейтронной спин-эхо спектроскопии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (49): 17646–51. Bibcode : 2005PNAS..10217646B. doi : 10.1073/pnas.0503388102 . PMC 1345721. PMID  16306270 . 
  17. ^ Li Y, Mitaxov V, Waksman G (август 1999). «Структурно-ориентированное проектирование Taq ДНК-полимераз с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (17): 9491–6. Bibcode : 1999PNAS ... 96.9491L. doi : 10.1073/pnas.96.17.9491 . PMC 22236. PMID  10449720. 
  18. ^ "Будет ли активность эндонуклеазы 5'→3'-лоскута Taq DNA Polymerase деградировать праймеры?". NEB . Получено 28 марта 2019 г. .
  19. ^ Экспрессия гена TaqMan - Проекты NCBI
  20. ^ Park Y, Choi H, Lee DS, Kim Y (июнь 1997 г.). «Улучшение 3'-5' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taq с помощью белковой инженерии в активном центре». Molecules and Cells . 7 (3): 419–24. PMID  9264032.
  21. ^ Villbrandt B, Sobek H, Frey B, Schomburg D (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana». Protein Engineering . 13 (9): 645–54. doi : 10.1093/protein/13.9.645 . PMID  11054459.
  22. ^ Ишино С., Ишино Й. (2014). «ДНК-полимеразы как полезные реагенты для биотехнологии — история исследований в этой области». Frontiers in Microbiology . 5 : 465. doi : 10.3389/fmicb.2014.00465 . PMC 4148896. PMID  25221550. 
  23. ^ Menon PK, Kapila K, Ohri VC (июль 1999 г.). «Полимеразная цепная реакция и достижения в диагностике инфекционных заболеваний». Медицинский журнал, Вооруженные силы Индии . 55 (3): 229–231. doi :10.1016/S0377-1237(17)30450-1. PMC 5531883. PMID  28775636 . 
  24. ^ "Полимеразная цепная реакция (ПЦР)". stanfordhealthcare.org . Получено 2020-04-23 .
  25. ^ "Глава FDA предупреждает о "давлении" поставок реагентов для тестов на коронавирус". MedTech Dive . Получено 23.04.2020 .
  26. ^ Overbaugh J, Jackson SM, Papenhausen MD, Rudensey LM (ноябрь 1996 г.). «Лентивирусные геномы с гипермутацией G-в-A могут быть результатом ошибок полимеразы Taq во время полимеразной цепной реакции». AIDS Research and Human Retroviruses . 12 (17): 1605–13. doi :10.1089/aid.1996.12.1605. PMID  8947295.