stringtranslate.com

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза ( TdT ), также известная как ДНК-нуклеотидилэксотрансфераза ( DNTT ) или терминальная трансфераза , является специализированной ДНК-полимеразой, экспрессируемой в незрелых, пре-B, пре-T лимфоидных клетках и клетках острого лимфобластного лейкоза /лимфомы. TdT добавляет N-нуклеотиды к экзонам V, D и J генов TCR и BCR во время рекомбинации генов антител , обеспечивая явление разнообразия соединений . У людей терминальная трансфераза кодируется геном DNTT . [ 5] [6] Как член семейства X ферментов ДНК-полимеразы , она работает совместно с полимеразой λ и полимеразой μ, оба из которых принадлежат к тому же семейству X ферментов полимеразы. Разнообразие, вносимое TdT, сыграло важную роль в эволюции иммунной системы позвоночных, значительно увеличив разнообразие антигенных рецепторов, которыми оснащена клетка для борьбы с патогенами. Исследования с использованием мышей с нокаутом TdT обнаружили резкое сокращение (в 10 раз) разнообразия рецепторов Т-клеток (TCR) по сравнению с нормальными или дикими системами. Большее разнообразие TCR, которыми оснащен организм, приводит к большей устойчивости к инфекции. [7] [8] Хотя TdT была одной из первых ДНК-полимераз, идентифицированных у млекопитающих в 1960 году, [9] она остается одной из наименее изученных из всех ДНК-полимераз. [7] В 2016–18 годах было обнаружено, что TdT демонстрирует зависимое от матрицы поведение в транс-положении в дополнение к его более широко известному независимому от матрицы поведению [10] [11]

TdT отсутствует в эмбриональных стволовых клетках печени , что значительно ухудшает разнообразие соединений в В-клетках в фетальный период. [12]

Функция и регулирование

Как правило, TdT катализирует добавление нуклеотидов к 3'-концу молекулы ДНК . В отличие от большинства ДНК-полимераз, ему не требуется шаблон. Предпочтительным субстратом этого фермента является 3'-выступ , но он также может добавлять нуклеотиды к тупым или утопленным 3'-концам. Кроме того, TdT является единственной полимеразой, которая, как известно, катализирует синтез 2-15-нуклеотидных ДНК-полимеров из свободных нуклеотидов в растворе in vivo . [13] In vitro такое поведение катализирует общее образование ДНК-полимеров без определенной длины. [14] Предполагается, что 2-15-нуклеотидные фрагменты ДНК, полученные in vivo, действуют в сигнальных путях, связанных с механизмами репарации и/или рекомбинации ДНК. [13] Как и многим полимеразам, TdT требуется кофактор двухвалентного катиона , [15] однако TdT уникален своей способностью использовать более широкий спектр катионов, таких как Mg2 + , Mn2 + , Zn2 + и Co2 + . [15] Скорость ферментативной активности зависит от доступных двухвалентных катионов и добавляемого нуклеотида. [16]

TdT экспрессируется в основном в первичных лимфоидных органах, таких как тимус и костный мозг. Регулирование его экспрессии происходит через несколько путей. Они включают белок-белковые взаимодействия, такие как взаимодействия с TdIF1. TdIF1 — это еще один белок, который взаимодействует с TdT, чтобы ингибировать его функцию, маскируя область связывания ДНК полимеразы TdT. Регулирование экспрессии TdT также существует на уровне транскрипции, причем на регуляцию влияют факторы, специфичные для стадии, и происходит ограничительным образом для развития. [7] [17] [18] Хотя экспрессия обычно обнаруживается в первичных лимфоидных органах, недавние исследования показали, что стимуляция через антиген может привести к вторичной экспрессии TdT вместе с другими ферментами, необходимыми для перестройки генов за пределами тимуса для Т-клеток. [19] Пациенты с острым лимфобластным лейкозом значительно перепроизводят TdT. [16] Клеточные линии, полученные от этих пациентов, послужили одним из первых источников чистого TdT и привели к открытию того, что существуют различия в активности между человеческими и бычьими изоформами. [16]

Механизм

График, описывающий механизм конденсации нуклеотидов с одноцепочечной ДНК, катализируемой терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой с двухвалентными катионными кофакторами. Два остатка аспартата облегчают связывание катионов и нуклеофильную атаку .

Подобно многим полимеразам , каталитический центр TdT имеет два двухвалентных катиона в своем домене ладони, которые способствуют связыванию нуклеотидов, помогают снизить pKa группы 3'-OH и в конечном итоге облегчают отвод образующегося побочного продукта пирофосфата. [20] [21]

Изоформная вариация

Несколько изоформ TdT были обнаружены у мышей, крупного рогатого скота и людей. На сегодняшний день у мышей были идентифицированы два варианта, а у людей — три. [22]

Два варианта сплайсинга, выявленные у мышей, названы в соответствии с их соответствующей длиной: TdTS состоит из 509 аминокислот, в то время как TdTL, более длинный вариант, состоит из 529 аминокислот. Различия между TdTS и TdTL возникают за пределами областей, которые связывают ДНК и нуклеотиды. То, что разница в 20 аминокислот влияет на ферментативную активность, является спорным, некоторые утверждают, что модификации TdTL придают экзонуклеазную активность, в то время как другие утверждают, что TdTL и TdTS имеют почти одинаковую активность in vitro . Кроме того, TdTL, как сообщается, может модулировать каталитическую активность TdTS in vivo посредством неизвестного механизма. Предполагается, что это помогает в регуляции роли TdT в рекомбинации V(D)J. [23]

Изоформы TdT человека имеют три варианта: TdTL1, TdTL2 и TdTS. TdTL1 широко экспрессируется в линиях лимфоидных клеток, тогда как TdTL2 преимущественно экспрессируется в нормальных малых лимфоцитах. Оба локализуются в ядре при экспрессии [24] и оба обладают 3'->5' экзонуклеазной активностью. [25] Напротив, изоформы TdTS не обладают экзонуклеазной активностью и выполняют необходимую элонгацию во время рекомбинации V(D)J. [25] Поскольку аналогичная экзонуклеазная активность, предполагаемая в мышином TdTL, обнаружена в человеческом и бычьем TdTL, некоторые постулируют, что изоформы бычьего и человеческого TdTL регулируют изоформы TdTS аналогичным образом, как это предполагается у мышей. [23] Кроме того, некоторые предполагают, что TdTL1 может быть вовлечен в регуляцию активности TdTL2 и/или TdTS.

Роль в рекомбинации V(D)J

На этом изображении показан механизм, описанный в статье.
Это изображение наглядно демонстрирует, как TdT работает в процессе перестройки гена антитела. Знайте, что хотя изображение использует сегменты D и J, тот же тип перестроек происходит и с другими парами сегментов.

Под действием ферментов RAG 1/2 расщепленная двухцепочечная ДНК остается со шпильковыми структурами в конце каждого сегмента ДНК, созданного в результате расщепления. Обе шпильки открываются комплексом Artemis , который обладает эндонуклеазной активностью при фосфорилировании, предоставляя свободные 3' OH концы для действия TdT. Как только комплекс Artemis выполнил свою работу и добавил палиндромные нуклеотиды (P-нуклеотиды) к вновь открытым шпилькам ДНК, сцена готова для выполнения TdT своей работы. Теперь TdT может войти и добавить N-нуклеотиды к существующим P-нуклеотидам в направлении от 5' к 3', в котором, как известно, функционируют полимеразы. В среднем 2-5 случайных пар оснований добавляются к каждому 3' концу, образованному после действия комплекса Artemis. Количество добавленных оснований достаточно для того, чтобы два вновь синтезированных сегмента одноцепочечной ДНК прошли микрогомологическое выравнивание во время негомологичного соединения концов в соответствии с обычными схемами спаривания оснований Уотсона-Крика (AT, CG). Оттуда неспаренные нуклеотиды вырезаются экзонуклеазой, например, комплексом Артемиды (который обладает экзонуклеазной активностью в дополнение к эндонуклеазной активности), а затем зависимые от матрицы полимеразы могут заполнить пробелы, в конечном итоге создавая новый кодирующий сустав с действием лигазы для объединения сегментов. Хотя TdT не различает четыре пары оснований при добавлении их к сегментам N-нуклеотидов, он показал смещение для пар оснований гуанина и цитозина . [7]

Зависимая от шаблона активность

TDT связан с тремя цепями ДНК, демонстрируя активную конфигурацию его шаблонно-зависимого катализа.

В зависимости от шаблона TdT может включать нуклеотиды через разрывы нитей в двухцепочечной ДНК способом, называемым in trans, в отличие от механизма in cis, обнаруженного в большинстве полимераз. Это происходит оптимально при разрыве одной пары оснований между цепями и в меньшей степени при увеличении зазора. Этому способствует подраздел TdT, называемый Loop1, который избирательно исследует короткие разрывы в двухцепочечной ДНК. Кроме того, открытие этой зависящей от шаблона активности привело к более убедительным механистическим гипотезам о том, как распределение длин добавлений N-областей возникает при рекомбинации V(D)J. [26]

Графическая диаграмма, изображающая зависимую от шаблона активность терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Петля 1 выделена красным.

Полимераза μ и полимераза λ проявляют схожую в транс -шаблонно-зависимой синтетической активности с TdT, но без схожей зависимости от нижестоящей двухцепочечной ДНК. [27] Кроме того, было обнаружено, что полимераза λ также проявляет схожую шаблонно-независимую синтетическую активность. Наряду с активностью в качестве терминальной трансферазы, известно, что она также работает в более общем шаблонно-зависимом режиме. [28] Сходство между TdT и полимеразой μ предполагает, что они тесно связаны эволюционно. [26]

Использует

Терминальная трансфераза имеет применение в молекулярной биологии . Она может использоваться в RACE для добавления нуклеотидов, которые затем могут быть использованы в качестве шаблона для праймера в последующей ПЦР. Она также может использоваться для добавления нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами, например, в анализе TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP Nick End Labeling ) для демонстрации апоптоза ( который маркируется , в частности , фрагментированной ДНК ) . Она также используется в иммунофлуоресцентном анализе для диагностики острого лимфобластного лейкоза . [29]

В иммуногистохимии и проточной цитометрии антитела к TdT могут использоваться для демонстрации наличия незрелых Т- и В-клеток и плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток, которые обладают антигеном, в то время как зрелые лимфоидные клетки всегда являются TdT-отрицательными. В то время как TdT-положительные клетки обнаруживаются в небольших количествах в здоровых лимфатических узлах и миндаликах, злокачественные клетки острого лимфобластного лейкоза также являются TdT-положительными, и поэтому антитело может использоваться как часть панели для диагностики этого заболевания и для отличия его, например, от мелкоклеточных опухолей у детей. [30]

TdT также недавно нашел применение в синтезе олигонуклеотидов De Novo, с аналогами, связанными с TdT-dNTP, способными удлинять праймер на 1 нт за раз. [31] Другими словами, фермент TdT продемонстрировал способность создавать синтетическую ДНК, добавляя по одной букве за раз к последовательности праймера.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abc GRCh38: Ensembl выпуск 89: ENSG00000107447 – Ensembl , май 2017 г.
  2. ^ abc GRCm38: Ensembl выпуск 89: ENSMUSG00000025014 – Ensembl , май 2017 г.
  3. ^ "Human PubMed Reference:". Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США .
  4. ^ "Mouse PubMed Reference:". Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США .
  5. ^ Isobe M, Huebner K, Erikson J, Peterson RC, Bollum FJ, Chang LM и др. (сентябрь 1985 г.). «Хромосомная локализация гена человеческой терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в области 10q23-q25». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 82 (17): 5836–40. Bibcode : 1985PNAS...82.5836I. doi : 10.1073/pnas.82.17.5836 . PMC 390648. PMID  3862101 . 
  6. ^ Yang-Feng TL, Landau NR, Baltimore D, Francke U (1986). «Ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы расположен на человеческой хромосоме 10 (10q23----q24) и на мышиной хромосоме 19». Cytogenetics and Cell Genetics . 43 (3–4): 121–6. doi :10.1159/000132309. PMID  3467897.
  7. ^ abcd Motea EA, Berdis AJ (май 2010 г.). «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза: история заблудшей ДНК-полимеразы». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Белки и протеомика . 1804 (5): 1151–66. doi :10.1016/j.bbapap.2009.06.030. PMC 2846215. PMID  19596089 . 
  8. ^ Haeryfar SM, Hickman HD, Irvine KR, Tscharke DC, Bennink JR, Yewdell JW (июль 2008 г.). «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза устанавливает и расширяет иерархии иммунодоминирования противовирусных CD8+ T-клеток». Журнал иммунологии . 181 (1): 649–59. doi :10.4049/jimmunol.181.1.649. PMC 2587314. PMID  18566432 . 
  9. ^ Bollum FJ (август 1960). «Полимераза тимуса теленка». Журнал биологической химии . 235 (8): 2399–403. doi : 10.1016/S0021-9258(18)64634-4 . PMID  13802334.
  10. ↑ Гуж Дж., Розарио С., Ромен Ф., Пуитевен Ф., Беген П., Деларю М. (апрель 2015 г.). «Структурная основа нового механизма соединения и выравнивания ДНК при репарации ДНК эукариотических DSB». Журнал ЭМБО . 34 (8): 1126–42. дои : 10.15252/embj.201489643. ПМК 4406656 . ПМИД  25762590. 
  11. ^ Loc'h J, Delarue M (декабрь 2018 г.). «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза: история нешаблонной ДНК-полимеразы, способной к образованию мостиков ДНК и шаблонному синтезу по цепям» (PDF) . Current Opinion in Structural Biology . 53 : 22–31. doi : 10.1016/j.sbi.2018.03.019. PMID  29656238. S2CID  4882661.
  12. ^ Харди Р. (2008). «Глава 7: Развитие и биология лимфоцитов B». В Поле У. (ред.). Фундаментальная иммунология (книга) (6-е изд.). Филадельфия: Lippincott Williams & Wilkins. стр. 237–269. ISBN 978-0-7817-6519-0.
  13. ^ ab Ramadan K, Shevelev IV, Maga G, Hübscher U (май 2004 г.). "Синтез ДНК de novo человеческой ДНК-полимеразой лямбда, ДНК-полимеразой мю и терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазой". Журнал молекулярной биологии . 339 (2): 395–404. doi :10.1016/j.jmb.2004.03.056. PMID  15136041.
  14. ^ Bollum FJ, Chang LM, Tsiapalis CM, Dorson JW (1974). "[8] Нуклеотидполимеризующие ферменты из тимуса теленка". Нуклеотидполимеризующие ферменты из тимуса теленка . Методы в энзимологии. Т. 29. С. 70–81. doi :10.1016/0076-6879(74)29010-4. ISBN 9780121818920. PMID  4853390.
  15. ^ ab Chang LM, Bollum FJ (апрель 1970 г.). «Доксинуклеотидполимеризующие ферменты тимуса теленка. IV. Ингибирование терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы металлическими лигандами». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 65 (4): 1041–8. Bibcode : 1970PNAS...65.1041C. doi : 10.1073/pnas.65.4.1041 . PMC 283020. PMID  4985880 . 
  16. ^ abc Deibel MR, Coleman MS (май 1980). «Биохимические свойства очищенной человеческой терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы». Журнал биологической химии . 255 (9): 4206–12. doi : 10.1016/S0021-9258(19)85653-3 . PMID  7372675.
  17. ^ Cherrier M, D'Andon MF, Rougeon F, Doyen N (февраль 2008 г.). «Идентификация нового цис-регуляторного элемента гена терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в 5'-области мышиного локуса». Молекулярная иммунология . 45 (4): 1009–17. doi :10.1016/j.molimm.2007.07.027. PMID  17854898.
  18. ^ Kubota T, Maezawa S, Koiwai K, Hayano T, Koiwai O (август 2007 г.). «Идентификация функциональных доменов в TdIF1 и его ингибирующий механизм для активности TdT». Genes to Cells . 12 (8): 941–59. doi : 10.1111/j.1365-2443.2007.01105.x . PMID  17663723. S2CID  25530793.
  19. ^ Zhang Y, Shi M, Wen Q, Luo W, Yang Z, Zhou M и др. (2012-01-01). «Антигенная стимуляция индуцирует рекомбинацию, активирующую ген 1, и терминальную экспрессию дезоксинуклеотидилтрансферазы в мышиной Т-клеточной гибридоме». Cellular Immunology . 274 (1–2): 19–25. doi :10.1016/j.cellimm.2012.02.008. PMID  22464913.
  20. ^ Vashishtha AK, Wang J, Konigsberg WH (сентябрь 2016 г.). «Различные двухвалентные катионы изменяют кинетику и точность ДНК-полимераз». Журнал биологической химии . 291 (40): 20869–20875. doi : 10.1074/jbc.R116.742494 . PMC 5076500. PMID  27462081 . 
  21. ^ Delarue M, Boulé JB, Lescar J, Expert-Bezançon N, Jourdan N, Sukumar N, et al. (Февраль 2002). «Кристаллические структуры независимой от шаблона ДНК-полимеразы: терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза мышей». The EMBO Journal . 21 (3): 427–39. doi :10.1093/emboj/21.3.427. PMC 125842. PMID  11823435. {{cite journal}}: CS1 maint: переопределенная настройка ( ссылка )
  22. ^ Steenberg ML, Lokhandwala MF, Jandhyala BS (1988). «Нарушения в транспорте натрия как причинный фактор повышенного переполнения норадреналина у спонтанно гипертензивных крыс». Клиническая и экспериментальная гипертензия, часть A. 10 (5): 833–41. doi :10.1080/07300077.1988.11878788. PMID  2846215.
  23. ^ ab Schmoldt A, Benthe HF, Haberland G (сентябрь 1975 г.). «Метаболизм дигитоксина микросомами печени крысы». Биохимическая фармакология . 24 (17): 1639–41. doi :10.1016/0006-2952(75)90094-5. hdl : 10033/333424 . PMID  10.
  24. ^ Thai TH, Kearney JF (сентябрь 2004 г.). «Различные и противоположные активности вариантов сплайсинга терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы человека». Журнал иммунологии . 173 (6): 4009–19. doi : 10.4049/jimmunol.173.6.4009 . PMID  15356150. S2CID  40193319.
  25. ^ ab Thai TH, Kearney JF (2005). Изоформы терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы: аспекты развития и функции . Достижения в иммунологии. Т. 86. С. 113–36. doi :10.1016/S0065-2776(04)86003-6. ISBN 9780120044863. PMID  15705420.
  26. ^ ab Bland RD, Clarke TL, Harden LB (февраль 1976 г.). «Быстрая инфузия бикарбоната натрия и альбумина недоношенным детям с высоким риском вскоре после рождения: контролируемое проспективное исследование». American Journal of Obstetrics and Gynecology . 124 (3): 263–7. doi :10.1016/0002-9378(76)90154-x. PMID  2013.
  27. ^ Martin MJ, Blanco L (июль 2014 г.). «Принятие решений во время NHEJ: сеть взаимодействий в человеческой Polμ, вовлеченных в распознавание субстрата и образование конечных мостиков». Nucleic Acids Research . 42 (12): 7923–34. doi :10.1093/nar/gku475. PMC 4081086. PMID  24878922 . 
  28. ^ Maga G, Ramadan K, Locatelli GA, Shevelev I, Spadari S, Hübscher U (январь 2005 г.). «Удлинение ДНК человеческой ДНК-полимеразой лямбда-полимеразой и терминальной трансферазной активностью дифференциально координируется пролиферирующим клеточным ядерным антигеном и репликационным белком A». Журнал биологической химии . 280 (3): 1971–81. doi : 10.1074/jbc.M411650200 . PMID  15537631. S2CID  43322190.
  29. ^ Faber J, Kantarjian H, Roberts MW, Keating M, Freireich E, Albitar M (январь 2000 г.). «Терминальный дезоксинуклеотидилтрансферазоотрицательный острый лимфобластный лейкоз». Архивы патологии и лабораторной медицины . 124 (1): 92–7. doi :10.5858/2000-124-0092-TDTNAL. PMID  10629138.
  30. ^ Леонг AS, Купер K, Леонг FJ (2003). Руководство по диагностической цитологии (2-е изд.). Greenwich Medical Media, Ltd. стр. 413–414. ISBN 1-84110-100-1.
  31. ^ Паллюк С., Арлоу Д.Х., де Ронд Т., Бартель С., Канг Дж.С., Бектор Р. и др. (август 2018 г.). «Синтез ДНК de novo с использованием конъюгатов полимеразы и нуклеотидов». Природная биотехнология . 36 (7): 645–650. дои : 10.1038/nbt.4173. OSTI  1461176. PMID  29912208. S2CID  49271982.

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки