Рентгеновский микроскоп использует электромагнитное излучение в рентгеновском диапазоне для получения увеличенных изображений объектов. Поскольку рентгеновские лучи проникают сквозь большинство объектов, нет необходимости в их специальной подготовке для рентгеновских микроскопических наблюдений.
В отличие от видимого света , рентгеновские лучи не отражаются и не преломляются легко и невидимы для человеческого глаза. Поэтому рентгеновский микроскоп экспонирует пленку или использует детектор с зарядовой связью (ПЗС) для обнаружения рентгеновских лучей, проходящих через образец. Это технология контрастной визуализации, использующая разницу в поглощении мягких рентгеновских лучей в области водного окна (длины волн: 2,34–4,4 нм, энергии: 280–530 эВ) атомом углерода (основной элемент, из которого состоит живая клетка) и атомом кислорода (элемент воды).
Микрофокусный рентгеновский луч также достигает высокого увеличения за счет проекции. Микрофокусная рентгеновская трубка производит рентгеновские лучи из чрезвычайно малого фокусного пятна (от 5 мкм до 0,1 мкм). Рентгеновские лучи находятся в более обычном рентгеновском диапазоне (от 20 до 300 кэВ) и не перефокусируются.
Историю рентгеновской микроскопии можно проследить до начала 20 века. После того, как немецкий физик Рентген открыл рентгеновские лучи в 1895 году, ученые вскоре осветили объект с помощью точечного источника рентгеновских лучей и получили теневые изображения объекта с разрешением в несколько микрометров. [2] В 1918 году Эйнштейн указал, что показатель преломления рентгеновских лучей в большинстве сред должен быть лишь немного больше 1, [3] что означает, что преломляющие оптические детали будет трудно использовать для рентгеновских приложений.
Ранние рентгеновские микроскопы Пола Киркпатрика и Альберта Баеза использовали скользящую отражательную рентгеновскую оптику для фокусировки рентгеновских лучей, которая отражала рентгеновские лучи от параболических изогнутых зеркал под очень большим углом падения . Альтернативный метод фокусировки рентгеновских лучей заключается в использовании крошечной зонной пластины Френеля из концентрических золотых или никелевых колец на подложке из диоксида кремния . Сэр Лоуренс Брэгг получил некоторые из первых пригодных для использования рентгеновских изображений с помощью своего аппарата в конце 1940-х годов.
В 1950-х годах компания Sterling Newberry создала теневой рентгеновский микроскоп, в котором образец помещался между источником и целевой пластиной. Это стало основой для первых коммерческих рентгеновских микроскопов компании General Electric .
После периода молчания в 1960-х годах рентгеновская микроскопия вновь привлекла внимание людей в 1970-х годах. В 1972 году Горовиц и Хауэлл построили первый синхротронный рентгеновский микроскоп в Кембриджском электронном ускорителе. [4] Этот микроскоп сканировал образцы, используя синхротронное излучение из крошечного отверстия, и демонстрировал возможности как просвечивающей, так и флуоресцентной микроскопии. Другие разработки в этот период включают первую голографическую демонстрацию Садао Аоки и Сейши Кикуты в Японии, [5] первые TXM с использованием зонных пластин Шмаля и др., [6] и эксперименты Стоуни Брука в STXM . [7] [8]
Использование синхротронных источников света открыло новые возможности для рентгеновской микроскопии в 1980-х годах. Однако, поскольку во многих группах были построены новые микроскопы на основе синхротронных источников, люди поняли, что проводить такие эксперименты сложно из-за недостаточных технологических возможностей того времени, таких как плохое когерентное освещение, некачественные рентгеновские оптические элементы и неудобные для пользователя источники света. [9]
В 1990-х годах новые инструменты и новые источники света значительно способствовали совершенствованию рентгеновской микроскопии. Были успешно продемонстрированы такие методы микроскопии, как томография, крио- и криотомография. Благодаря быстрому развитию рентгеновская микроскопия нашла новые применения в почвоведении, геохимии, полимерных науках и магнетизме. Аппаратное обеспечение также было миниатюризировано, так что исследователи могли проводить эксперименты в своих собственных лабораториях. [9]
Источники рентгеновского излучения чрезвычайно высокой интенсивности 9,25 кэВ для рентгеновской фазово-контрастной микроскопии из фокусного пятна размером около 10 мкм × 10 мкм могут быть получены с помощью несинхротронного рентгеновского источника, который использует сфокусированный электронный пучок и жидкометаллический анод. Это было продемонстрировано в 2003 году, а в 2017 году было использовано для получения изображения мозга мыши при размере воксела около одного кубического микрометра (см. ниже). [10]
С ростом числа приложений рентгеновская микроскопия стала обычной, проверенной техникой, используемой в науках об окружающей среде и почве, гео- и космохимии, полимерных науках, биологии, магнетизме, материаловедении. С ростом спроса на рентгеновскую микроскопию в этих областях по всему миру строятся микроскопы на основе синхротрона, жидкометаллического анода и других лабораторных источников света. Рентгеновская оптика и компоненты также быстро коммерциализируются. [9]
Advanced Light Source (ALS) в Беркли, Калифорния, является домом для XM-1, мягкого рентгеновского микроскопа полного поля, управляемого Центром рентгеновской оптики и предназначенного для различных приложений в современной нанонауке, таких как наномагнитные материалы, экология и материаловедение и биология. XM-1 использует рентгеновскую линзу для фокусировки рентгеновских лучей на ПЗС, аналогично оптическому микроскопу. XM-1 установил мировой рекорд по пространственному разрешению с зонными пластинами Френеля до 15 нм и способен сочетать высокое пространственное разрешение с временным разрешением менее 100 пс для изучения, например, сверхбыстрой динамики спина. В июле 2012 года группа в DESY заявила о рекордном пространственном разрешении в 10 нм, используя жесткий рентгеновский сканирующий микроскоп на PETRA III . [11]
ALS также является домом для первого в мире мягкого рентгеновского микроскопа, разработанного для биологических и биомедицинских исследований. Этот новый инструмент, XM-2, был разработан и создан учеными из Национального центра рентгеновской томографии. XM-2 способен производить трехмерные томограммы клеток.
Источники чрезвычайно высокой интенсивности рентгеновских лучей 9,25 кэВ (линия галлия K-альфа) для рентгеновской фазово-контрастной микроскопии из фокусного пятна около 10 мкм x 10 мкм могут быть получены с помощью источника рентгеновского излучения, который использует анод из жидкого металла галинстан . Это было продемонстрировано в 2003 году. [10] Металл течет из сопла вниз с высокой скоростью, и источник электронов высокой интенсивности фокусируется на нем. Быстрый поток металла переносит ток, но физический поток предотвращает большой нагрев анода (из-за принудительно-конвективного отвода тепла), а высокая температура кипения галинстана препятствует испарению анода. Эта техника была использована для получения изображения мозга мыши в трех измерениях при размере вокселя около одного кубического микрометра. [12]
Источники мягкого рентгеновского излучения, подходящие для микроскопии, такие как источники синхротронного излучения, имеют довольно низкую яркость требуемых длин волн, поэтому альтернативным методом формирования изображения является сканирующая просвечивающая мягкая рентгеновская микроскопия. Здесь рентгеновские лучи фокусируются в точку, а образец механически сканируется через полученное фокусное пятно. В каждой точке прошедшие рентгеновские лучи регистрируются с помощью детектора, такого как пропорциональный счетчик или лавинный фотодиод . Этот тип сканирующего просвечивающего рентгеновского микроскопа (STXM) был впервые разработан исследователями из Университета Стоуни-Брук и использовался в Национальном источнике синхротронного света в Брукхейвенской национальной лаборатории .
Разрешение рентгеновской микроскопии находится между разрешением оптического микроскопа и электронного микроскопа . Преимущество рентгеновской микроскопии перед обычной электронной микроскопией заключается в том, что она позволяет просматривать биологические образцы в их естественном состоянии. Электронная микроскопия широко используется для получения изображений с разрешением от нанометра до субангстрема, но относительно толстую живую клетку невозможно наблюдать, поскольку образец необходимо химически зафиксировать, обезвожить, залить смолой, а затем нарезать ультратонкими ломтиками. Однако следует отметить, что криоэлектронная микроскопия позволяет наблюдать биологические образцы в их гидратированном естественном состоянии, хотя и залитые в водяной лед. До сих пор разрешение в 30 нанометров было возможно с использованием линзы с зонной пластиной Френеля, которая формирует изображение с помощью мягкого рентгеновского излучения, испускаемого синхротроном. В последнее время все более популярным становится использование мягкого рентгеновского излучения, испускаемого лазерной плазмой, а не синхротронным излучением.
Кроме того, рентгеновские лучи вызывают флуоресценцию в большинстве материалов, и эти излучения можно анализировать для определения химических элементов отображаемого объекта. Другое применение — создание дифракционных картин, процесс, используемый в рентгеновской кристаллографии . Анализируя внутренние отражения дифракционной картины (обычно с помощью компьютерной программы), можно определить трехмерную структуру кристалла вплоть до расположения отдельных атомов в его молекулах. Рентгеновские микроскопы иногда используются для этих анализов, поскольку образцы слишком малы для анализа каким-либо другим способом.
Одним из первых применений рентгеновской микроскопии в биологии была контактная визуализация, впервые разработанная Гоби в 1913 году. В этой технике мягкие рентгеновские лучи облучают образец и экспонируют рентгеновские чувствительные эмульсии под ним. Затем увеличенные томографические изображения эмульсий, которые соответствуют картам рентгеновской непрозрачности образца, регистрируются с помощью светового микроскопа или электронного микроскопа. Уникальным преимуществом, которое предлагала рентгеновская контактная визуализация по сравнению с электронной микроскопией, была возможность получать изображения влажных биологических материалов. Таким образом, она использовалась для изучения микро- и наномасштабных структур растений, насекомых и человеческих клеток. Однако несколько факторов, включая искажения эмульсии, плохие условия освещения и низкое разрешение способов исследования эмульсий, ограничивают разрешение контактной визуализации. Электронное повреждение эмульсий и эффекты дифракции также могут приводить к появлению артефактов на конечных изображениях. [13]
Рентгеновская микроскопия имеет свои уникальные преимущества с точки зрения наномасштабного разрешения и высокой проникающей способности, оба из которых необходимы в биологических исследованиях. С недавним значительным прогрессом в области инструментов и фокусировки три классические формы оптики — дифракционная, [14] отражательная, [15] [16] преломляющая [17] оптика — успешно расширились в рентгеновском диапазоне и использовались для исследования структур и динамики в клеточном и субклеточном масштабах. В 2005 году Шапиро и др. сообщили о получении клеточной визуализации дрожжей с разрешением 30 нм с использованием когерентной мягкой рентгеновской дифракционной микроскопии. [18] В 2008 году была продемонстрирована рентгеновская визуализация неокрашенного вируса. [19] Год спустя рентгеновская дифракция была дополнительно применена для визуализации трехмерной структуры неокрашенной человеческой хромосомы. [20] Таким образом, рентгеновская микроскопия продемонстрировала свою замечательную способность обходить дифракционный предел классических световых микроскопов; однако дальнейшее повышение разрешения ограничено пикселями детектора, оптическими приборами и размерами источника.
Долгосрочной серьезной проблемой рентгеновской микроскопии является радиационное повреждение, поскольку высокоэнергетические рентгеновские лучи производят сильные радикалы и вызывают вредные реакции во влажных образцах. В результате биологические образцы обычно фиксируются или подвергаются сублимационной сушке перед облучением мощными рентгеновскими лучами. Быстрая криообработка также широко используется для сохранения неповрежденных гидратированных структур. [21]
