В энзимологии аланинрацемаза ( КФ 5.1.1.1) — фермент , катализирующий химическую реакцию .
Следовательно, этот фермент имеет один субстрат — L-аланин и один продукт — D-аланин .
Этот фермент принадлежит к семейству изомераз , а именно к рацемазам и эпимеразам , действующим на аминокислоты и их производные. Систематическое название этого класса ферментов — аланинрацемаза . Этот фермент также называют L-аланинрацемазой . Этот фермент участвует в метаболизме аланина и аспартата , а также метаболизме D- аланина . В нем используется один кофактор – пиридоксальфосфат . Известно, что по крайней мере два соединения, 3-фтор-D-аланин и D-циклосерин, ингибируют этот фермент .
D-аланин, продуцируемый аланинрацемазой, используется для биосинтеза пептидогликана. Пептидогликан содержится в клеточных стенках всех бактерий, в том числе многих вредных для человека. Фермент отсутствует у высших эукариот, но встречается повсеместно у прокариот, что делает аланинрацемазу отличной мишенью для разработки противомикробных препаратов. [1] Аланиновую рацемазу можно обнаружить у некоторых беспозвоночных. [2]
Бактерии могут иметь один (ген alr) или два гена аланинрацемазы. У видов бактерий с двумя генами аланинрацемазы один из них экспрессируется постоянно, а другой индуцируется, что затрудняет выборку обоих генов для исследований лекарств. Однако нокаутные исследования показали, что без экспрессии гена alr бактериям для выживания потребуется внешний источник D-аланина. Таким образом, ген alr является возможной мишенью для противомикробных препаратов. [1]
По состоянию на 2002 год аланинрацемаза - единственный известный белок, содержащий левую α-спираль из 5 аминокислот, самую длинную левую α-спираль, обнаруженную на тот момент. [3]
Чтобы катализировать взаимное превращение D и L-аланина, аланиновая рацемаза должна располагать остатки, способные обмениваться протонами, по обе стороны от альфа-углерода аланина. Структурные исследования комплексов фермент-ингибитор позволяют предположить, что этими остатками являются тирозин 265 и лизин 39. Альфа-протон L-энантиомера ориентирован на Tyr265, а альфа-протон D-энантиомера ориентирован на Lys39 (рис. 1).
Расстояние между остатками фермента и энантиомерами составляет 3,5 Å и 3,6 Å соответственно. [4] Структурные исследования комплексов ферментов с синтетическим аналогом L-аланина, ингибитором прочного связывания [5] и пропионатом [6] дополнительно подтверждают, что Tyr265 и Lys39 являются каталитическими основаниями для реакции. [5] [7]
Комплексы PLP-L-Ala и PLP-D-Ala почти совмещаемы. [4] Области, которые не перекрываются, представляют собой плечи, соединяющие пиридиновое кольцо PLP и альфа-углерод аланина. Взаимодействие между атомами кислорода фосфата и атомами азота пиридина с 5'-фосфопиридоксильной областью PLP-Ala, вероятно, создает прочное связывание с ферментом. [4]
Структура аланинрацемазы из Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) была определена методом рентгеновской кристаллографии с разрешением 1,9 А. [7] Мономер аланинрацемазы состоит из двух доменов, восьмицепочечного альфа/бета-цилиндра на N конец, и С-концевой домен, по существу состоящий из бета-цепи. Модель двухдоменной структуры показана на рисунке 2. N-концевой домен также обнаружен в семействе белков PROSC ( бактериальный гомолог , котранскрибируемый пролинсинтетазой ), которые, как известно, не обладают аланинрацемазной активностью. Кофактор пиридоксаль -5'-фосфат (PLP) расположен внутри и над устьем альфа-/бета-цилиндра и ковалентно связан через альдиминовую связь с остатком лизина , который находится на С-конце первой бета-цепи альфа-цепи. /бета-баррель.
Механизмы реакции трудно полностью доказать экспериментально. Традиционный механизм, приписываемый аланинрацемазной реакции, представляет собой двухосновный механизм с промежуточным карбанионом, стабилизированным PLP. PLP используется в качестве стока электронов для стабилизации отрицательного заряда, возникающего в результате депротонирования альфа-углерода. Двухосновной механизм способствует специфичности реакции по сравнению с одноосновным механизмом. Второй каталитический остаток заранее расположен для быстрой отдачи протона после образования карбанионного промежуточного продукта и, таким образом, снижает вероятность возникновения альтернативных реакций. Как выявили Ватанабэ и др., есть два потенциальных конфликта с этим традиционным механизмом. Во-первых, Arg219 образует водородную связь с пиридиновым азотом PLP. [7] Группа аргинина имеет pKa около 12,6 и поэтому маловероятно, что она будет протонировать пиридин. Обычно в реакциях PLP кислый аминокислотный остаток, такой как группа карбоновой кислоты, с pKa около 5, протонирует пиридиновое кольцо. [8] Протонирование пиридинового азота позволяет азоту принять дополнительный отрицательный заряд. Следовательно, из-за Arg219 образование промежуточного карбаниона, стабилизированного PLP, менее вероятно. Другая выявленная проблема заключалась в необходимости другого основного остатка для возврата Lys39 и Tyr265 обратно в их протонированные и непротонированные формы для L-аланина и наоборот для D-аланина. Ватанабэ и др. не обнаружили аминокислотных остатков или молекул воды, кроме карбоксилатной группы PLP-Ala, которые были бы достаточно близки (в пределах 4,5 А) для протонирования или депротонирования Lys или Tyr. Это показано на рисунке 3. [4]
На основе кристаллических структур N-(5'-фосфопиридоксил)L-аланина (PKP-L-Ala ( и N-(5'-фосфопиридоксил)D-аланина (PLP-D-Ala)
Ватанабэ и др. предложил альтернативный механизм в 2002 году, как видно на рисунке 4. В этом механизме карбоксилатные атомы кислорода PLP-Ala непосредственно участвуют в катализе, опосредуя перенос протона между Lys39 и Tyr265. Кристаллизационная структура показала, что отношение карбоксилатного кислорода PLP-L-Ala к OH Tyr265 составляло всего 3,6 А, а соотношение карбоксилатного кислорода PLP-L-Ala к азоту Lys39 составляло только 3,5 А. Следовательно, оба были достаточно близки, чтобы вызвать реакцию.
Этот механизм поддерживается мутациями Arg219. Мутации, превращающие Arg219 в карбоксилат, приводят к обнаружению хиноноидного промежуточного соединения, тогда как в случае с аргинином ничего не обнаружено. [9] Промежуточный аргинин имеет гораздо больше свободной энергии и более нестабильен, чем мутанты с кислотным остатком. [8] Дестабилизация промежуточного продукта повышает специфичность реакции. [9] [10]
