Бимолекулярная флуоресцентная комплементация (также известная как BiFC ) — это технология, обычно используемая для проверки белковых взаимодействий. Он основан на ассоциации фрагментов флуоресцентного белка, присоединенных к компонентам одного макромолекулярного комплекса. Белки, которые, как предполагается, взаимодействуют, сливаются с развернутыми комплементарными фрагментами флуоресцентного репортерного белка и экспрессируются в живых клетках. Взаимодействие этих белков приведет к сближению флуоресцентных фрагментов, позволяя репортерному белку преобразоваться в свою нативную трехмерную структуру и излучать флуоресцентный сигнал. [1] Этот флуоресцентный сигнал можно обнаружить и локализовать внутри клетки с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа , который позволяет визуализировать флуоресценцию в клетках. Кроме того, интенсивность испускаемой флуоресценции пропорциональна силе взаимодействия: более высокие уровни флуоресценции указывают на тесные или прямые взаимодействия, а более низкие уровни флуоресценции предполагают взаимодействие внутри комплекса. [2] Таким образом, посредством визуализации и анализа интенсивности и распределения флуоресценции в этих клетках можно идентифицировать как расположение, так и партнеров по взаимодействию интересующих белков.
Биохимическая комплементация была впервые описана в бычьей панкреатической рибонуклеазе , расщепленной субтилизином , а затем была расширена с использованием мутантов β-галактозидазы , которые позволили клеткам расти на лактозе. [3] [4] [5]
Признание способности многих белков спонтанно собираться в функциональные комплексы, а также способности белковых фрагментов собираться как следствие спонтанной сборки функционального комплекса партнеров по взаимодействию, с которыми они слиты, было позже сообщено для фрагментов убиквитина во взаимодействиях дрожжевых белков. [6]
В 2000 году Гош и др. разработали систему, которая позволяла повторно собирать зеленый флуоресцентный белок ( GFP ) с использованием антипараллельной лейциновой застежки в клетках E. coli . [7] Это было достигнуто путем разделения GFP на C- и N-концевые фрагменты GFP. Поскольку фрагмент GFP был прикреплен к каждой лейциновой застежке с помощью линкера, гетеродимеризация антипараллельной лейциновой застежки приводила к восстановленному или реформированному белку GFP, который можно было визуализировать. Успешный флуоресцентный сигнал показал, что отдельные фрагменты пептида GFP смогли правильно собраться и достичь третичного сворачивания . Поэтому было предположено, что с помощью этого метода фрагментированный GFP можно использовать для изучения взаимодействия белок-белковых пар, N-C-концы которых находятся в непосредственной близости.
После демонстрации успешного восстановления фрагментов флуоресцентного белка в клетках млекопитающих Hu et al . описали использование фрагментированного желтого флуоресцентного белка ( YFP ) в исследовании взаимодействий транскрипционных факторов семейства bZIP и Rel . [8] Это было первое сообщение о регуляции взаимодействия белков bZIP областями за пределами домена bZIP , регулировании субъядерной локализации доменов bZIP Fos и Jun их различными взаимодействующими партнерами и модуляции активации транскрипции белков bZIP и Rel посредством взаимных взаимодействий. . Кроме того, это исследование стало первым сообщением о методе in vivo , теперь известном как анализ бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC), который дает представление о структурной основе формирования белковых комплексов путем обнаружения флуоресценции, вызванной сборкой флуоресцентного репортерного белка. фрагменты, связанные с взаимодействующими белками. [8] [9]
Активация флуорофора происходит посредством автокаталитической реакции циклизации, которая происходит после правильного сворачивания белка. [10] Это стало возможным благодаря успешному восстановлению флуорофора YFP из фрагментов белка, которые были слиты с взаимодействующими белками в течение 8 часов после трансфекции, о чем сообщалось в 2002 году. [8]
Существуют различные производственные системы , которые можно использовать для получения гибридного белка. Транзиентную экспрессию генов используют для идентификации белок-белковых взаимодействий in vivo , а также при субклеточной локализации комплекса BiFC. Однако следует быть осторожным с чрезмерной экспрессией белка, поскольку это может исказить как предпочтительную локализацию, так и формирование преобладающих белковых комплексов. Вместо этого следует использовать слабые промоторы , использование низких уровней плазмидной ДНК при трансфекции и плазмидные векторы, которые не реплицируются в клетках млекопитающих, для экспрессии белков на их эндогенных уровнях или около них для имитации физиологической клеточной среды. [11] Кроме того, важен тщательный выбор флуоресцентного белка, поскольку разные флуоресцентные белки требуют разной клеточной среды. Например, GFP можно использовать в клетках E. coli , а YFP — в клетках млекопитающих. [12]
Стабильные клеточные линии с вектором экспрессии, интегрированным в их геном, обеспечивают более стабильную экспрессию генов в популяции клеток, что приводит к более стабильным результатам. [1]
При выборе места слияния линкера на поверхности белка необходимо учитывать три основных фактора. Во-первых, фрагменты флуоресцентного белка должны иметь возможность связываться друг с другом при взаимодействии их связанных белков. [11] Структурная информация и расположение поверхности взаимодействия могут быть полезны при определении места слияния с линкером, хотя эта информация не является необходимой, поскольку можно отфильтровать множество комбинаций и перестановок. [11] Во-вторых, создание слитого белка не должно существенно изменять локализацию, стабильность или экспрессию белков, с которыми связаны фрагменты, по сравнению с эндогенными белками дикого типа . [11] Наконец, добавление слитого флуоресцентного фрагмента не должно влиять на биологическую функцию белка, предпочтительно проверенную с помощью анализов, которые оценивают все известные функции белков. [11]
Линкер представляет собой короткую аминокислотную последовательность , которая связывает фрагмент флуоресцентного репортерного белка с интересующим белком, образуя слитый белок. При разработке линкерной последовательности необходимо убедиться, что линкер достаточно растворим и длинный, чтобы обеспечить фрагментам флуоресцентного белка гибкость и свободу движения, чтобы фрагмент и его партнерский фрагмент сталкивались достаточно часто, чтобы восстановиться во время взаимодействия их соответствующих слитых фрагментов. белки. [1] Хотя это не документировано, возможно, что длина или последовательность линкера могут влиять на комплементацию некоторых белков. [11] Сообщаемые линкерные последовательности RSIAT и RPACKIPNDLKQKVMNH (код одной аминокислоты) и AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) были успешно использованы в экспериментах с BiFC. [8] [13]
При разработке плазмидных векторов для экспрессии интересующих белков конструкция должна быть способна экспрессировать белки, способные образовывать слитые белки с фрагментами флуоресцентных белков без нарушения функции белка. Кроме того, ожидаемый белковый комплекс должен быть способен стабилизировать взаимодействие фрагментов флуоресцентного белка, не влияя на функцию белкового комплекса или исследуемую клетку. В BiFC можно использовать многие фрагменты флуоресцентных белков, которые комбинируются несколькими способами. [8] [13] Как правило, YFP рекомендуется использовать в качестве репортерного белка, расщепленного по остатку 155 (N-концевой, состоящий из остатков 1–154, и С-концевой, состоящий из остатков 155–238) или по остатку 173, в частности, как эти наборы фрагментов очень эффективны в комплементации при слиянии со многими взаимодействующими белками и производят флуоресценцию низкого уровня при слиянии с невзаимодействующими белками. Предполагается, что каждый белок-мишень поочередно слит как с N-, так и с С-концевыми фрагментами флуоресцентного репортерного белка, и что эти фрагменты слиты на каждом из N- и С-концевых концов белков-мишеней. Это позволит использовать в общей сложности восемь различных перестановок с тестируемыми взаимодействиями: [1]
N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 1 + С-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 1 + С-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 2
С-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
С-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 2
С-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
С-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 2
Как указывалось ранее, важно убедиться, что флуоресцентный репортерный белок, используемый в BiFC, является подходящим и может быть экспрессирован в выбранной системе клеточной культуры , поскольку не все репортерные белки могут флуоресцировать или визуализироваться во всех модельных системах .
Фрагменты флуоресцентного белка могут ассоциироваться и флуоресцировать с низкой эффективностью в отсутствие специфического взаимодействия. Поэтому важно включать контрольные элементы , чтобы гарантировать, что флуоресценция от восстановления флуоресцентного репортерного белка не связана с неспецифическим контактом. [14]
Некоторые контроли включают фрагменты флуорофора, связанные с невзаимодействующими белками, поскольку присутствие этих слияний имеет тенденцию уменьшать неспецифическую комплементацию и ложноположительные результаты. [7]
Другой контроль создается путем связывания фрагмента флуоресцентного белка с белками с мутированными поверхностями взаимодействия. [8] [13] Пока флуоресцентный фрагмент слит с мутировавшими белками таким же образом, как белок дикого типа, и мутация не влияет на уровни экспрессии и локализацию гена , это служит сильным отрицательным контролем. поскольку мутантные белки и, следовательно, флуоресцентные фрагменты не должны взаимодействовать.
Внутренний контроль также необходим для нормализации различий в эффективности трансфекции и экспрессии генов в разных клетках. Это достигается путем совместной трансфекции клеток плазмидами, кодирующими представляющие интерес слитые белки, а также целым (нефрагментированным) белком, который флуоресцирует на длине волны, отличной от флуоресцентного репортерного белка. Во время визуализации определяют интенсивность флуоресценции комплекса BiFC и внутреннего контроля, который после вычета фонового сигнала становится соотношением. Это соотношение представляет собой эффективность BiFC, и его можно сравнивать с другими соотношениями для определения относительной эффективности образования различных комплексов. [11]
После того как слитые белки и контроли разработаны и созданы в соответствующей системе экспрессии, плазмиды необходимо трансфицировать в клетки, подлежащие изучению. После трансфекции необходимо подождать, обычно около восьми часов, чтобы дать время слитым белкам взаимодействовать, а их связанные фрагменты флуоресцентного репортерного белка соединиться и флуоресцировать. [8]
По прошествии достаточного времени для взаимодействия и флуоресценции слитых белков и связанных с ними флуоресцентных фрагментов клетки можно наблюдать под инвертированным флуоресцентным микроскопом, который может визуализировать флуоресценцию в клетках. Хотя интенсивность флуоресценции комплексов BiFC обычно составляет <10% от интенсивности флуоресценции, производимой при экспрессии интактных флуоресцентных белков, чрезвычайно низкая автофлуоресценция в видимом диапазоне у большинства клеток часто делает сигнал BiFC на порядки выше фоновой флуоресценции. [15]
Если флуоресценция обнаруживается при экспрессии слитых белков, но отсутствует или значительно снижается после экспрессии мутированного отрицательного контроля, вполне вероятно, что между двумя представляющими интерес белками-мишенями происходит специфическое взаимодействие. Однако если интенсивность флуоресценции существенно не отличается между мутировавшим слитым белком отрицательного контроля и его аналогом дикого типа, то флуоресценция, вероятно, вызвана неспецифическими белковыми взаимодействиями, поэтому следует протестировать другую комбинацию конформаций слитого белка.
Если флуоресценция не обнаружена, между интересующими белками все еще может существовать взаимодействие, поскольку создание слитого белка может изменить структуру или поверхность взаимодействия целевого белка, или фрагменты флуоресценции могут оказаться физически неспособными связываться. Чтобы гарантировать, что этот результат не является ложноотрицательным и что взаимодействие отсутствует, взаимодействие белков необходимо тестировать в ситуации, когда для комплементации и активации флуоресценции требуется внешний сигнал. В этом случае, если внешний сигнал не может вызвать ассоциацию фрагментов флуоресценции, вполне вероятно, что белки не взаимодействуют или существует физическое препятствие для комплементации флуоресценции. [11]
Белки взаимодействуют с различными белками-партнерами и другими макромолекулами для достижения функций, которые поддерживают различные функции в клетках, поддерживающие выживание организма. Выявление этих взаимодействий может дать ключ к пониманию их влияния на клеточные процессы. Поскольку на эти взаимодействия могут влиять как внутренняя среда, так и внешние раздражители, изучение этих взаимодействий in vivo и на эндогенных уровнях, как рекомендуется в BiFC, обеспечивает физиологически значимый контекст, на основе которого можно сделать выводы о белковых взаимодействиях.
BiFC позволяет напрямую визуализировать белковые взаимодействия в живых клетках с ограниченным возмущением клеток , вместо того, чтобы полагаться на вторичные эффекты или окрашивание экзогенными молекулами, которые могут не распределяться равномерно. [1] Это, а также возможность наблюдать за живыми клетками в течение длительного периода времени, становится возможным благодаря сильной внутренней флуоресценции восстановленного репортерного белка, что снижает вероятность неправильного считывания, связанного с процессом выделения белка. [1] [16]
В отличие от многих анализов взаимодействия белков in vivo , BiFC не требует, чтобы белковые комплексы образовывались большой частью белков или в стехиометрических пропорциях. Вместо этого BiFC может обнаруживать взаимодействия между субпопуляциями белков , слабые взаимодействия и белки с низкой экспрессией из-за стабильной комплементации флуоресцентного репортерного белка. [12] [17] Кроме того, сообщалось об успешном восстановлении флуоресцентного белка для белков-партнеров, находящихся на расстоянии более 7 нм друг от друга, при условии, что линкеры, связывающие фрагмент флуорофора с интересующим белком, обладают гибкостью, необходимой для связывания с соответствующим фрагментом. [14] Кроме того, сила взаимодействия белков может быть количественно определена по изменениям силы флуоресцентного сигнала. [2]
BiFC позволяет измерять пространственные и временные изменения в белковых комплексах, даже в ответ на активирующие и ингибирующие препараты, а также на субклеточном уровне, обеспечивая высочайшее пространственное разрешение анализов межбелкового взаимодействия in vivo . [8] [18] [19]
BiFC не требует специального оборудования, поскольку визуализация возможна с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, способного обнаруживать флуоресценцию в клетках. [14] Кроме того, анализ не требует сложной обработки данных или коррекции на другие источники флуоресценции. [8]
BiFC можно выполнять без структурной информации о партнерах по взаимодействию, при условии, что фрагменты флуоресцентного репортерного белка могут ассоциироваться внутри комплекса, поскольку можно проверять несколько комбинаций слитых белков. Это связано с предположением, что, поскольку функции белка повторяются в контексте in vivo , сложная структура будет напоминать структуру интактных белков, видимых физиологически. [15]
Технология BiFC была усовершенствована и расширена и теперь включает в себя возможности одновременной визуализации нескольких белковых комплексов в одной и той же клетке, взаимодействий РНК/белок, быстрого обнаружения изменений в путях трансдукции генов, демонстрации скрытых фенотипов лекарств, где прогнозируемый результат лечения (т.е. смерть клеток, дифференциация, морфологические изменения) не наблюдается in vivo , изучить образование комплексов в различных клеточных компартментах и составить карту поверхностей взаимодействия белков [13] [19] [20] [21] [22]
Флуоресцентный сигнал возникает только после взаимодействия белков, что обычно занимает несколько часов. Следовательно, BiFC не может обеспечить обнаружение белковых взаимодействий в реальном времени. Задержка химических реакций генерации флуорофора также может влиять на динамику комплексной диссоциации и обмена партнерами. [1] [7] [8] [23]
Образование комплекса BiFC обратимо только на начальном этапе повторной сборки флуоресцентного репортерного белка, обычно в течение миллисекунд. После восстановления флуорохрома его действие in vitro практически необратимо . Это предотвращает взаимодействие белков с другими и может нарушить ассоциацию/диссоциацию белковых комплексов, находящихся в динамическом равновесии . [1]
Фрагменты флуоресцентных белков обладают ограниченной способностью к ассоциации независимо от белков, с которыми они слиты. Хотя белок-независимая ассоциация будет варьироваться в зависимости от идентичности слитых белков и уровней их экспрессии, необходимо обеспечить необходимые и многочисленные средства контроля, чтобы различать истинные и ложноположительные белковые взаимодействия. Как правило, это ограничение смягчается за счет обеспечения экспрессии представляющих интерес слитых белков в эндогенных концентрациях. [1]
Связывание флуоресцентных фрагментов может изменить укладку или структуру интересующего белка, что приведет к устранению поверхностного сайта связывания взаимодействующего белка. Кроме того, расположение флуоресцентных фрагментов может предотвратить восстановление флуорофора за счет стерических затруднений , хотя стерические затруднения можно уменьшить или устранить с помощью линкерной последовательности, которая обеспечивает достаточную гибкость для ассоциации флуоресцентных фрагментов. Следовательно, отсутствие комплементарности флуоресценции может быть ложноотрицательным и не обязательно доказывает, что рассматриваемое взаимодействие не происходит.
Из-за необходимости молекулярного кислорода для образования флуорофора BiFC нельзя использовать у облигатных анаэробов , которые не могут выжить в присутствии кислорода. Это ограничивает использование BiFC аэробными организмами . [1]
Автофлуоресценция обычно не является проблемой, поскольку сигнал BiFC будет намного выше фона. [24] [25] Однако некоторые организмы, особенно apicomplexa , имеют более высокую автофлуоресценцию, что затрудняет применение BiFC к ним. [26] Некоторые грибы, такие как Candida albicans , также имеют высокий автофлуоресцентный фон, но BiFC часто все же можно проводить при использовании соответствующих контролей и штаммов. [27] [28]
Поскольку эндогенные белки дикого типа невозможно визуализировать in vivo , необходимо создать слитые белки и трансфицировать их плазмиды в изучаемые клетки. Эти слитые белки могут не повторять функции, локализацию и взаимодействия, общие для их аналогов дикого типа, что дает неточную картину рассматриваемых белков. Эту проблему можно облегчить, используя структурную информацию и расположение сайтов взаимодействия для рациональной идентификации сайтов слияния на интересующих белках, используя соответствующие контроли и сравнивая уровни экспрессии и функции слитых белков и белков дикого типа с помощью вестерн-блоттинга и функционального анализа. анализы. [1]
Хотя низкие температуры способствуют восстановлению флуоресценции, когда фрагменты находятся в непосредственной близости, это может повлиять на поведение белков-мишеней, приводя к неточным выводам относительно природы взаимодействий белков и их взаимодействующих партнеров. [17]
Поскольку восстановление флуорофора может происходить на расстоянии 7 нм и более, комплементация флуоресценции может указывать как на прямое, так и на непрямое (т.е. в пределах одного и того же комплекса) взаимодействие между слитыми белками флуоресцентных фрагментов. [16]
В дополнение к проверке белок-белковых взаимодействий, описанной выше, BiFC был расширен и адаптирован для других приложений:
Система BiFC применялась для регистрации событий биогенеза рибосом в E.coli . [29] Процесс сборки рибосом включает зарождение рибосомальных белков в правильном порядке и ориентации. Нарушения сборки могут привести к структурным дефектам субъединиц рибосом, которые в результате не могут соединиться в правильной ориентации и сформировать полностью функциональные рибосомы. Таким образом, события соединения субъединиц, сигнализируемые появлением BiFC, являются простым способом мониторинга биогенеза рибосом в отличие от трудоемких методов профилирования полисом.
Фрагменты флуоресцентного белка, используемые в BiFC, были расширены и теперь включают синий, голубой, зеленый, желтый, красный, вишневый и цвет Венеры . [8] [13] [30] [31] Этот диапазон цветов сделал возможным развитие многоцветного флуоресцентного комплементарного анализа. [13] Этот метод позволяет одновременно визуализировать несколько белковых комплексов в одной клетке. Кроме того, белки обычно имеют большое количество альтернативных партнеров по взаимодействию. Следовательно, соединяя фрагменты разных флуоресцентных белков с белками-кандидатами, можно изучать конкуренцию между альтернативными партнерами по взаимодействию за образование комплекса посредством комплементации различных флуоресцентных цветных фрагментов. [13]
BiFC был расширен за счет включения изучения взаимодействий РНК-связывающих белков с помощью метода Рэкхэма и Брауна, описанного как тримолекулярная флуоресцентная комплементация (TriFC). [20] В этом методе фрагмент флуоресцентного белка Венеры слит с интересующей мРНК , а комплементарная часть Венеры слита с интересующим РНК-связывающим белком . Как и в случае с BiFC, если мРНК и белок взаимодействуют, белок Венеры восстанавливается и флуоресцирует. Также известный как метод моста РНК, поскольку флуорофор и другие взаимодействующие белки образуют мост между белком и интересующей РНК, он позволяет просто обнаруживать и локализовать взаимодействия РНК-белок внутри живой клетки, а также обеспечивает простой метод обнаружения прямая или непрямая ассоциация РНК-белок (т.е. внутри комплекса), которую можно проверить посредством анализа очищенных соединений in vitro или нокдауна РНКи мостиковой молекулы(-ов). [20]
BiFC можно использовать для связи генов друг с другом и их функций путем измерения взаимодействий между белками, которые кодируют гены. [21] [22] Это приложение идеально подходит для новых генов, в которых мало что известно об их эффекторах выше и ниже , поскольку могут быть созданы новые связи путей. Кроме того, в течение нескольких секунд можно наблюдать влияние лекарств, гормонов , делеции или нокдауна интересующего гена, а также последующее влияние как на силу белок-белковых взаимодействий, так и на место взаимодействия. [18] [19]
BiFC использовался для изучения ядерной транслокации посредством сложной локализации, а также взаимодействий с участием интегральных мембранных белков . [8] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] Таким образом, BiFC является важным инструментом в понимании локализации транскрипционных факторов в субклеточных компартментах.
BiFC сочетается с проточной цитометрией (BiFC-FC). Это позволяет картировать поверхности белок-белкового взаимодействия посредством введения сайт-направленных или случайных мутаций, которые влияют на образование комплекса. [2]
Большинство методов, используемых для изучения белок-белковых взаимодействий, основаны на методах in vitro . К сожалению, изучение белков в искусственной системе, вне их клеточного окружения, сопряжено с рядом трудностей. Например, это может потребовать удаления белков из их нормального клеточного окружения. Обработка, необходимая для выделения белка, может повлиять на его взаимодействие с другими белками. Кроме того, выделение белка из внутриклеточной передачи сигналов и механизмов, которые происходят в нормальной клетке, может дать ошибочную картину внутриклеточных и физиологических явлений. [1] Кроме того, белки, изучаемые in vitro, могут изучаться в концентрациях, значительно отличающихся от их нормального уровня содержания, не обязательно могут эффективно транспортироваться в клетки или могут быть недостаточно селективными, чтобы функционировать в геноме хозяина. [39] [40] [41] [42] Наконец, изучая белки in vitro , невозможно определить влияние специфических белок-белковых взаимодействий в клетке на функциональные или физиологические последствия.
Другие анализы in vivo, наиболее часто используемые для изучения межбелковых взаимодействий, включают анализ резонансного переноса энергии флуоресценции ( FRET ) и двухгибридный дрожжевой анализ ( Y2H ). Каждый из этих анализов имеет свои преимущества и недостатки по сравнению с BiFC:
Резонансный перенос энергии флуоресценции ( FRET ), также известный как резонансный перенос энергии Фёрстера , резонансный перенос энергии ( RET ) или перенос электронной энергии ( EET ), основан на передаче энергии от возбужденного ( донорного ) хромофора или флуорофора (если хромофоры флуоресцентны) к ближайшему акцептору . В этом методе флуорофоры химически связаны или генетически слиты с двумя белками, которые, как предполагается, взаимодействуют. Если белки взаимодействуют, это приведет к тому, что флуорофоры окажутся в непосредственной пространственной близости. Если флуорофоры ориентированы таким образом, что флуорофоры подвергаются воздействию друг друга, что обычно обеспечивается при проектировании и конструировании связи/слияния флуорофор-белок, то передача энергии от возбужденного донорного флуорофора приведет к изменению интенсивности флуоресценции или времени жизни. из флуорофоров. [1] [14]
Двойной гибрид дрожжей ( Y2H ) представляет собой метод генетического скрининга, который можно использовать для обнаружения физических (связывающих) взаимодействий белок-белок или белок-ДНК . Обычно его применяют на модельном дрожжевом организме Saccharomyces cerevisiae . Он тестирует белок-приманку с (не)известной функцией, который слит, например, со связывающим доменом транскрипционного фактора GAL4, против потенциально взаимодействующих белков или библиотеки кДНК, которая экспрессирует, например, домен активации GAL4 (« добыча'). [43] [44]